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水稻戊糖磷酸途径两个关键酶基因的克隆与功能分析 戊糖磷酸途径(PPP:pentose phosphate pathway)是植物体中糖代谢的重要途径,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH:Glucose-6-phophate dehydrogenase)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH:6-phosphogluconate dehydrogenase)是戊糖磷酸途径的两个关键酶(或称限速酶),它们都是细胞核基因编码的产物,广泛存在于高等植物的细胞质和质体中。由于生长发育的需要或为了适应环境的不断变化,植物必须对这个代谢途径进行精细的调节。目前,已经从拟南芥、烟草、马铃薯和菠菜等不同植物中分别克隆到细胞质和质体的G6PDH或6PGDH基因。根据质体G6PDH的氨基酸差异和蛋白免疫特性的不同,质体的G6PDH可分为P1和P2两类。 分别以拟南芥质体G6PDH基因(登录号:AY099561)和水稻胞质Os6PGDH1(登录号:AF486280)的氨基酸序列为信息探针,利用BLAST软件搜索水稻基因组数据库,发现与之同源的水稻基因组序列,经过FGENESH程序分析和拼接得到了水稻质体G6PDH和质体6PGDH基因的cDNA序列。进一步采用RT-PCR的方法从水稻幼苗中分离得到了水稻质体G6PDH和质体6PGDH基因的cDNA克隆,分别命名为OsG6PDH2和Os6PGDH2,在Genbank中的登录号分别为AY339367和AY278362。本实验室已经从水稻中分离了胞质G6PDH(OsG6PDH1)和6PGDH(Os6PGDH1)基因,实现了从同一作物中克隆得到G6PDH和6PGDH胞质与质体同工酶基因的目的,为进一步研究植物戊糖磷酸途径的亚细胞分布以及生理生化功能奠定了基础。 通过与其对应的基因组序列比较,发现水稻G6PDH和6PGDH基因在基因组结构上存在很大差异,OsG6PDH1和OsG6PDH2含有多个外显子,胞质OsG6PDH1的外显子数目多于质体OsG6PDH2;而Os6PGDH1和Os6PGDH2在其编码区序列中没有内含子。结合对双子叶模式作物拟南芥G6PDH和6PGDH基因的结构和进化分析结果,我们认为高等植物G6PDH和6PGDH基因在进化方式上截然不同:G6PDH的胞质基因与动物、真菌等真核生物具有共同的祖先,而其质体基因在进化方式上更趋向于蓝藻,表明了其内共生的起源;6PGDH的胞质酶和质体酶基因都起源于原核生物的内共生。 采用半定量RT-PCR方法比较了OsG6PDHs和Os6PGDHs在水稻不同组织的表达特性,结果表明:OsG6PDH1在开花1w德、根申呈组成性高丰度表达;Os6PGDH1在开花1w穗、茎和根中的表达量高;OsG6PDH2在各个组织中呈微弱表达,在根中表达量相对较高,推测OsG6PDH2可能属于P2类质体基因;Os6PGDH2在叶片和开花1w后的穗中的表达量明显高于根部,暗示Os6PGDH2可能分布在叶绿体中。