作为一种具有多向分化潜能（向成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞及成肌细胞等多种组织分化）的成体干细胞,间充质干细胞（Mesenchymal stem cell,MSC）最初在组织工程中以“种子细胞”的角色参与组织修复和再生而倍受重视。近期研究发现MSC还具有特殊的造血调控及免疫调节作用,并在造血重建、移植免疫和基因治疗等多方面展现出良好的应用前景。在少数的几个Ⅰ期临床试验中已观察到了令人鼓舞的结果,如HSC/MSC共移植能明显促进受体的造血恢复,减少移植相关并发症,尤其是可降低GVHD的发生。但目前MSC联合移植防治GVHD的研究尚处于起步阶段,还有许多问题亟待解决。如MSC移植后在受体内发挥免疫调节效应的机制迄今仍不明确,部分体外研究、动物实验及Ⅰ期临床试验的结论也还存在着不一致,已报道的少数临床资料多不是随机或对照研究,近期还有研究显示MSC共移植并不能证实减少了GVHD的发生和减轻了严重程度,这些都提示MSC对GVHD的防治作用可能有限或需配合其它措施,基于HSC/MSC共移植对部分高GVHD风险（如单倍型或非血缘供体移植）和高植入失败风险（如脐血及非清髓移植）的病例可能是一种极有临床应用前景的移植策略,是否可以通过基因转染修饰的MSC移植来增强其体内免疫调节效应?近年MSC已成为基因治疗中理想的靶细胞之一,可稳定表达多种外源性目的基因,且回输后植入反应弱,因此通过基因转染MSC进行基因治疗理论上是可行的。既往的研究已明确,GVHD的中心环节是免疫活性T细胞的激活,而发病的重要因素及介质是细胞因子分泌异常,细胞因子失调通过级联放大效应诱导“细胞因子灾难”,是各种因素加重GVHD的最终共同通路,利用Ⅱ类细胞因子负调控Th1细胞及单核/巨噬细胞功能,诱使Th1反应向Th2方向“漂变”,减少GVHD致病因子（如IL-1,IL-2,IFN-γ,TNF-a,NO等）生成,是控制GVHD而保留GVL效应的有效策略之一。白细胞介素10（IL-10）作为一种理想的抗炎因子,可抑制T淋巴细胞和单核/巨噬细胞等炎症细胞的激活及多种炎症因子的合成,而从起始到效应阶段都可抑制Th1型细胞免疫反应,更提示IL-10在干预GVHD的发生和进程中具有潜在的重要作用。近期研究认为基于IL-10的抗炎特性及IL-10与树突状细胞（DC）、调节性T细胞（Treg）的联系,对于诱导外周免疫耐受及植入存活都是有益的,已有研究者发现IL-10分泌的低水平与GVHD的高发生率有关。由此,我们设想如以IL-10基因转染修饰的骨髓MSC共移植,能否与IL-10协同发挥免疫抑制效应,联合细胞治疗与基因治疗的优势,阻止或减轻GVHD?但由于伦理学和方法学的限制,使我们无法在人体内进行相关的MSC移植免疫学研究。基于上述设想,本研究拟解决以下主要问题:1.分离、培养小鼠骨髓间充质干/祖细胞（mMSC/MPC）,确保其良好的增殖能力和多向分化潜能,研究其生物学特征,并对相关生物学特性进行初步研究,为其后进行基因转染修饰及应用于动物模型做准备。2.构建并制备载有mIL-10基因的复制缺陷型腺病毒载体,并证实该病毒载体可高效转染mMSC/MPC并获得高效稳定的体外表达,以符合体内实验要求。3.建立适宜的H-2单倍型骨髓移植aGVHD模型,在此基础上分别进行MSC/MPC及mIL-10基因转染修饰MSC/MPC的共移植,观察相应的免疫生物学效应。通过如上研究探讨MSC/MPC移植能否在受体内诱发免疫耐受及其可能的相关机制,观察IL-10基因转染修饰的MSC/MPC能否协同发挥免疫调节活性,增强免疫耐受效应,并对其在移植中的免疫生物学行为进行初步研究,为潜在的GVHD防治新策略提供理论及实验的依据。第一部分:小鼠骨髓间充质干/祖细胞体外培养体系的优化及相关生物学研究方法:无菌剥离SPF级雌性C57BL╱6小鼠股骨与胫骨,以培养基反复强力冲洗并刮擦髓腔内膜后收集冲洗液,加入碎骨片振荡冲洗,过200目滤网制备为单细胞悬液。分别以3种完全培养基（低糖DMEM完全培养基,低糖DMEM/MCDB201完全培养基,Mesencult完全培养基）重悬,以1×10⁶/cm²的密度接种于25cm²滤膜培养瓶,转细胞培养箱,37℃,5%C02,100%饱和湿度条件下培养。24小时后全量换液,去除未贴壁细胞,此后每3日换液一次。镜下贴壁细胞约70%-80%汇合时消化,以2.5～5×10³/cm²密度接种传代。对不同代数的培养细胞进行如下检测:倒置显微镜下形态学特点观察;不同培养体系小鼠成纤维细胞样集落形成单位（CFU-F）的检测;计数绘制细胞生长曲线及倍增时间;流式细胞仪细胞周期检测;流式细胞仪检测细胞表面标记;体外定向诱导向成骨、成脂肪分化,鉴定多向分化潜能;RT-PCR法检测细胞mIL-10mRNA;双抗体夹心ELISA法检测细胞培养上清中mIL-10。采用SPSS 11.5 FOR WINDOWS统计处理软件分析,检验水准α=0.05。结果:收集经骨片冲洗的小鼠骨髓冲出液接种培养,经传代培养3代以上后细胞呈现为均质性较好的短梭形细胞,漩涡或放射状生长;优化选择Mesencult完全培养基为MSC/MPC培养体系;细胞可传代生长10代以上保持生物学特性稳定,选择P3代培养细胞为实验用细胞;对数生长期的群体倍增时间（Td）为31.1±0.6小时;细胞汇合80%-90%时G0/G1期细胞百分率80.3%,G2期细胞12.4%,S期细胞7.3%;P3代细胞表面抗原高表达CD29、CD44、CD105、Sca-1,极低表达CD45,低到中度表达CD31;P3代细胞经体外定向诱导培养,可分化为成骨及脂肪细胞,证实所培养细胞具备多向分化潜能;RT-PCR法检测培养细胞mIL-10mRNA,双抗体夹心ELISA法检测细胞培养上清中mIL-10,均未能证实mMSC/MPC体外表达分泌mIL-10。第二部分:mIL-10重组复制缺陷型腺病毒载体的构建制备及转染mMSC/MPC表达方法:以pORF5-mIL-10质粒为模板,PCR扩增回收mIL-10 cDNA,经一系列酶切和连接反应,将其定向插入腺病毒载体pSGCMV中,构建pSGCMV-mIL10质粒;此质粒与5型腺病毒质粒pBGHE3通过脂质体Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,经胞内同源重组产生重组复制缺陷型腺病毒Ad5-mIL-10;经纯化后的Ad5-mIL-10在HEK293细胞中大量扩增,并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,制备病毒液,50%组织培养感染剂量法（TCID50）测定病毒滴度;以Ad5-EGFP腺病毒确定转染mMSC/MPC的最宜感染复数（MOI）,Ad5-mIL10腺病毒体外转染mMSC/MPC;RT-PCR法检测Ad5-mIL10转染mMSC/MPC后mIL10的mRNA表达,ELISA法检测Ad5-mIL10转染mMSC/MPC培养上清中mIL-10。结果:扩增产物经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序均证实为小鼠白介素10;构建制备的重组腺病毒Ad5-mIL-10经PCR鉴定正确,滴度达2.5×10¹⁰pfu/ml;Ad5-mIL-10以最宜MOI值200转染mMSC/MPC时能获得高效稳定的体外表达,符合体内实验要求。第三部分:mIL-10基因转染修饰骨髓间充质干/祖细胞在H-2单倍型骨髓移植aGVHD模型中的生物免疫学效应方法:以雌性C57BL/6小鼠为供鼠,雄性F1（CB6F1）小鼠为受鼠,建立H-2单倍型骨髓移植aGVHD模型:对受鼠进行直线加速器6mvX射线一次性全身照射,总剂量12Gy,剂量率100cGy/min。制备供鼠1:0,1:1,1:2,1:3四种比例的骨髓单个核细胞（MNC）/脾MNC混合悬液（骨髓MNC取1×10⁷/只）,每比例为一实验组（n=15）。受鼠于照射后4小时内经尾静脉回输相应混合悬液,移植后进行一般情况观察,定期体重监测、外周血象及嵌合体测定,GVHD临床综合评分,组织病理学半定量评分,以综合评判各组aGVHD效应,最终确定引出理想aGVHD状态的相关参数,建立H-2单倍型骨髓移植aGVHD模型;选择1×10⁵/只和5×10⁵/只两个剂量梯度作为MSC/MPC移植剂量,在H-2单倍型骨髓移植aGVHD模型中,分别以MSC/MPC及mIL-10基因转染修饰的MSC/MPC进行共移植实验,对相应的4个共移植实验组及aGVHD对照组进行移植后一般情况观察,定期体重监测,外周血象及嵌合体测定,GVHD临床综合评分,组织病理学半定量评分,对各组GVHD状况进行综合评价,并选择移植后14天、28天、35天、60天及濒死前等不同的时间点,采集制备各组实验鼠血清,以ELISA法进行mIL-10、mIL-4、mINF-γ及mTNF-a定量检测。采用SPSS 11.5 FOR WINDOWS统计软件分析数据,检验水准α=0.05。结果:雄性F1（CB6F1）小鼠为受鼠,经直线加速器6mvX射线一次性全身照射（总剂量12Gy,剂量率100cGy/min）,接受雌性C57BL/6供鼠1×10⁷骨髓MNC/3×10⁷脾MNC（每只）联合输注时,可在相对集中的时间内（+24d～+28d）稳定地引出典型aGVHD,临床及病理程度较一致,死亡时间相对集中（+27d～+33d）,以此为参数建立H-2单倍型骨髓移植aGVHD模型;体内共移植实验结果显示:以1×10⁵/只MSC/MPC共移植时可降低aGVHD的发生及严重程度（P＜0.05）,提高细胞剂量（5×10⁵/只）并不能增强实验效应（P＞0.05）;同细胞剂量的mIL-10基因转染修饰MSC/MPC共移植能更为显著地减低aGVHD的发生及严重程度（P＜0.01）,但并不能降低甚至可能会加重cGVHD的发生及严重程度,提高细胞剂量其效应无显著差别（P＞0.05）。细胞因子检测显示:MSC/MPC共移植在+14d明显上调受鼠体内IL-4水平（P＜0.01）,对IL-10影响不显著（P＞0.05）,同时明显减低INF-γ和TNF-a水平（P均＜0.05）;mIL-10基因转染修饰的MSC/MPC共移植较MSC/MPC更高地上调了受鼠体内IL-10水平（P＜0.01）,同时协同上调IL-4水平（P＜0.05）,更显著地减少了INF-γ生成（P＜0.01）,但IL-10水平的上升可能也增加了受鼠发生及加重cGVHD的风险。结论:1.成功分离、培养了正常C57BL/6小鼠的骨髓间充质干/祖细胞,生物学特性稳定,具有良好的增殖能力和向成骨、脂肪细胞的分化潜能,可用于进行基因转染修饰及应用于动物模型。2.成功构建了重组AD5-mIL-10复制缺陷型腺病毒载体系统,并证实对mMSC/MPC具有较高的转染效率并获得高效稳定的体外表达.。3.成功建立了雌性C57BL/6小鼠→F1（CB6F1）雄性小鼠方向的H-2单倍型骨髓移植aGVHD模型。1×10⁵/R MSC/MPC共移植可降低aGVHD的发生及严重程度,提高细胞剂量（5×10⁵/只）并不能增强效应。不同程度地上调受鼠IL-4水平（但对IL-10影响不显著）,同时明显减低INF-γ和TNF-a水平,这可能是MSC/MPC移植减轻aGVHD的机制之一。1×10⁵/只mIL-10基因转染修饰MSC/MPC共移植能更显著地减低aGVHD的发生及严重程度,但并不能降低甚至可能会加重cGVHD的发生及严重程度,提高细胞剂量其效应无显著差别;mIL-10基因转染修饰MSC/MPC较未修饰者更高地上调了受鼠IL-10水平,同时协同上调体内IL-4水平,更为显著地减少INF-γ生成,可能是最终显著降低aGVHD发生及严重程度的原因,但IL-10水平上调也增加了受鼠发生及加重cGVHD的风险。