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该研究利用生物信息学方法找出了一株钝顶螺旋蓝细菌基因组中与酵母3,5-二磷酸核苷酸酶基因HAL2高度同源的基因ArHAL.将该基因克隆到大肠杆菌表达载体上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中超量表达,测定该基因体外表达产物的酶学性质以及超表达大肠杆菌的抗盐能力;同时,通过三亲本接合转移的方法,进一步将该基因转入鱼腥蓝细菌中,在鱼腥蓝细菌体内进行了超量表达,并检测了该基因对蓝细菌抗盐能力的影响.1.同源序列分析.经生物信息学方法查找分析,发现钝顶螺旋蓝细菌Arthrospira platensis的基因组中存在一个与酵母Saccharomyces cerevisae中3,5-二磷酸核苷酸酶基因HAL2高度同源的基因,我们暂将它命名为ArHAL.这个基因含有一个957bp的ORF,它编码了一条319个氨基酸的多肽链.分析发现该基因与HAL2同属于一类被称作肌醇单磷酸酶的蛋白家族,该蛋白家族具有非常保守的结构域及活性位点.前人的研究结果已证实:在酵母及拟南芥中,这类酶与硫的同化代谢途径相关,并且是金属离子产生毒性的靶点;同时这类酶的超表达能使生物表现出对高浓度盐离子的耐受性.2.钝顶螺旋蓝细菌Arthrospira platensis基因ArHAL的功能研究.首先利用钝顶螺旋蓝细菌基因组中该基因的序列设计带有EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切位点的特异性引物.在PCR的辅助下,将该基因克隆到A/T克隆载体pMD18-T上,利用PCR扩增片段中的EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切位点将基因插入大肠杆菌表达载体pET28a(+)中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得超表达ADrHAL基因的菌株.在IPTG的诱导下获得该基因的超表达蛋白,经亲和层析柱纯化后测定其磷酸酶的性质.动力学研究表明该酶对底物PAP,PAPS,5-ADP的Km值分别为:3.56,0.52,41.5mmol/L;V<,max>分别为:1111,125.6263.2μmol/L.min<-1>.mg<-1>,因此该酶初步定义为3,5-二磷酸核苷酸酶.同时测定了金属离子对酶活性的影响,结果表明:在K<+>存在的情况下,该酶的活性上升了近20﹪;Na<+>对酶活的半抑制浓度约为600mmol/L;1mmol/L的Li<+>几乎对酶活没有影响.这个来源于Arthrospira platensis的ArHAL产物与来源于其它物种的3,5-二磷酸核苷酸酶相比,最显著的差别在于该酶不受低离子浓度Li<+>的抑制.其原因有待进一步研究,但很大的可能是氨基酸序列中活性位点发生了改变.同时分别在LB培养基与基本培养基中检测超表达大肠杆菌菌株的抗盐能力是否有所改变.结果显示:与对照菌BL21相比,超表达菌株BL21/pRLArHAL在基本培养基中的生长较好;但在含盐的基本培养基中,两种菌的生长差异性并未明显增大.进一步将该基因克隆到在蓝细菌和大肠杆菌中都能表达的穿梭载体pRL25C中,通过三亲本接合转移,使其在鱼腥蓝细菌PCC7120中超表达.转基因蓝细菌经PCR和RT-PCR验证为阳性克隆子,表明该基因在鱼腥蓝细菌PCC7120中确实得到了转录.但在盐胁迫条件下,未观察到转基因蓝细菌与对照菌之间在抗盐能力上有明显的差异,其原因有待进一步研究.