膀胱癌是指发生在膀胱粘膜上皮的恶性肿瘤,是泌尿系统常见肿瘤,其在恶性肿瘤发病率的世界排名中位居第九。其高复发和高转移的生物学特性,使患者的生存期大大缩短,严重威胁着人类的健康。寻找更有效的化疗药物,不仅可以提高不能手术的患者治疗的有效率,同时还为应用术后辅助治疗的患者在降低复发转移及改善预后方面提供了更有效的解决方案。本实验中采用国内外较少研究的丝裂霉素联合尼美舒利作为研究对象,以膀胱癌EJ细胞为实验对象,探讨该联合用药的有效率。丝裂霉素是从上世纪开始采用的一代化疗药物,属抗生素类化疗药物,由链霉菌提取,化学结构具有苯醌、乙酰亚胺基及氨甲酰三个活性基团,作用与烷化剂相似,与DNA链形成交联,抑制DNA复制,对RNA也有抑制作用,从而抑制细胞的有丝分裂过程,抗肿瘤形成。属细胞周期非特异性药物。主要用于各种实体肿瘤如胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和癌性胸、腹水等。其治疗效果明确,是表浅性膀胱癌术灌注化疗及晚期复发转移和不能手术的膀胱癌患者全身化疗的常用的化疗药物之一。尼美舒利是一种非甾体类抗炎药,属于环氧化酶II抑制剂。其作用机制为可以选择性抑制环氧合酶Ⅱ,近年来相关研究表明,环氧化酶II(cyclooxygenase-2,COX-2)在恶性肿瘤细胞的生长、增殖过程中起重要作用,它可促进肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤的侵袭、转移等。例如,有研究发现在膀胱癌细胞中环氧化酶-2表达增高,参与肿瘤细胞的生长增殖及凋亡,同时在肿瘤组织血管生成、生物性转移过程中有重要作用。选择性环氧化酶-2抑制剂如塞来昔布、尼美舒利可明显抑制膀胱癌细胞生长增殖、诱导凋亡、抑制新生血管和淋巴管生成等,从而抑制肿瘤侵袭和转移。另有研究证实,在卵巢癌治疗的体内外研究中,选择性环氧化酶-2抑制剂同样可以通过抑制瘤体内环氧化酶-2的表达,降低VEGF的表达,减少血管生成及促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。因此,针对膀胱癌中高表达的环氧化酶-2,可以选用选择性环氧化酶-2抑制剂来治疗。目的:本实验主要探讨尼美舒利(选择性环氧化酶-2抑制剂)联合丝裂霉素对膀胱癌ej细胞的抑制作用。应用以上两种药物体外作用于ej细胞,通过测定凋亡相关基因caspase-3/bax/bcl-2在ej细胞上的表达,观察对膀胱癌ej细胞促凋亡作用。方法:1.细胞来源:人膀胱癌ej细胞株(购自上海美轩生物科技有限公司),药物培养时间分别为24h、48h、72h。2.实验分组:采用随机对照原则分对照组和实验组,对照组即不做处理的细胞培养液作阴性对照,实验组按实验药物不同分3组:丝裂霉素c组,浓度为2mg/l;尼美舒利组,浓度为300umol/l;丝裂霉素c(2mg/l)联合尼美舒利组(300umol/l)。3.对照组和实验组培养24h,48h,72h,q-pcr法测定各干预组细胞bcl-2mrna、baxmrna及caspase3mrna表达的差异。4.对照组和实验组培养24h,48h,72h,westernblot法测定各干预组细胞bcl-2蛋白、bax蛋白及caspase3蛋白表达的差异。5.统计分析:实验数据使用spss19.0,分别用均数±标准差(x±s)的数据进行表示。多组之间的比较使用单因素析因方差分析法,两组之间的比较使用snk法,p<0.01则表示差异有统计学意义。结果:1.q-pcr法测各实验组及空白对照组膀胱癌ej细胞中bcl-2mrna、baxmrna及caspas3mrna的表达:分别作用24h、48h、72h后,与空白对照组相比,各实验组的bcl-2mrna的表达均降低,baxmrna及caspase3mrna均升高,差异有统计学意义。其中与单药组相比,联合组的bcl-2mrna的表达最低,同时baxmrna及caspase3的表达最高(p<0.01,差异具有统计学意义);且随作用时间的延长,联合组中bcl-2mrna的表达逐渐降低,baxmrna及caspase3mrna的表达逐渐升高,作用72h时作用最明显(p<0.01,差异有统计学意义)。western-blot法测各实验组及空白对照组膀胱癌EJ细胞中Bcl-2、Bax及Caspas3蛋白的表达:分别作用24h、48h、72h后,与空白对照组相比,各实验组的Bcl-2蛋白的表达均降低,Bax及Caspase3蛋白均升高,差异有统计学意义。其中与单药组相比,联合组的Bcl-2蛋白的表达最低,同时Bax及Caspase3蛋白的表达最高(P<0.05,差异具有统计学意义);且随作用时间的延长,联合组中Bcl-2蛋白的表达逐渐降低,Bax及Caspase3蛋白的表达逐渐升高,作用72h时作用最明显(P<0.05,差异有统计学意义)。结论:丝裂霉素C联合尼美舒利在抑制膀胱癌EJ细胞的生长,促进细胞凋亡的过程中有协同作用,且随作用时间的延长抑制作用增强。作用机制主要与凋亡相关基因Bcl-2、Bax及Caspase3的表达相关。