研究背景：西洋参(学名：Panax quinquefolius)是五加科人参属多年生草本植物,别名花旗参、洋参、西洋人参、American ginseng,原产于加拿大的魁北克与美国的威斯康辛州,在我国北京怀柔与长白山等地也有种植。作为上千年来的补气保健首选药材,西洋参的保护作用基本涵盖心血管系统、免疫系统、神经系统、内分泌系统、血液系统等几乎所有人体系统,其中,在心血管系统中,长期服用西洋参可抗心律失常,抗心肌缺血,抗心肌氧化,强化心肌收缩能力,调节血压,有助于心律失常、冠心病、高血压、心衰、心梗、脑血栓等多种疾病的恢复。由于西洋参含有上千种组分,其在不同系统中的具体药效机制尚不明了,虽然西洋参皂苷是目前认为西洋参中最主要的有效成分之一,也是生理活性最显著的物质,但是否存在其他有效成分在心血管系统中发挥作用尚不明确。近年来,心血管疾病的发病率和死亡率逐年上升,俨然成为严重威胁人类生命和健康的首要疾病。代偿性心肌肥大多见于运动员和长期从事重体力劳动的工作者,主要特征是心肌总量增加,收缩力增强,心室后壁和室间隔肥厚,使心脏得以维持正常的血循环,也见于某些疾病的早期阶段。若诸如高血压,甲亢等病因不能被及时消除,心肌肥大失代偿,可导致单位重量的心肌供氧减少,ATP功能不足,单位面积的钠钾离子通道和那钙离子通道数量减少,最终心腔扩张,泵血能力下降等不可逆病理损伤。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2),包含589个氨基酸残基,是启动内源性抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE片段,其核心序列是5’-TGACnnnGC-3’[n代表任何碱基])的转录因子之一,是CNC (Cap’ n ’collar)转录因子家族中的一员。Nrf2在正常情况下,与Keap1相结合,在细胞质中不断泛素化,进而被降解,使细胞中Nrf2维持在很低的水平,其半衰周期仅为20分钟。而细胞受到刺激时,Nrf2与Keapl结合受到影响,使Nrf2进入细胞核内,发挥其转录因子的作用,促进一系列下游因子如NADPH:醌类氧化还原酶(NQO-1),血红素加氧酶1(HO-1),谷胱甘肽巯基转移酶(GST)等的表达,起到增强细胞防御功能的作用。Nrf2可以与ARE相结合,从而影响近200种靶基因的表达,大致包括细胞内抗氧化酶,II相解毒酶,转录因子,转运子,清除剂受体以及分子伴侣等。我们的前期研究结果发现,心脏特异性过表达Nrf2具有保护心肌细胞的作用,而将Nrf2敲除后,小鼠出现心室重构和心功能失常。虽然上述现象的具体机制尚不明了,但我们由此得知,Nrf2可以影响很多小分子物质,或使其表达水平改变,或合成基础条件下不存在的分子,一些分子可以起到Nrf2激动剂的作用,从而激发Nrf2对各个脏器的保护作用。目前,Nrf2在循环系统中尤其是对心脏的保护作用越来越引起学者的广泛关注,其作为有效药物靶点保护或治疗心力衰竭等疾病的研究也越来越多。近期的结果显示,西洋参可以抑制巨噬细胞中脂多糖(LPS)诱导的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)表达,并可促进Nrf2在核内的积聚,而这一过程不依赖于NF-κB信号通路；西洋参还可以通过激活Nrf2,保护H9c2大鼠心肌细胞系因氧化应激导致的细胞死亡。另一方面,我们还发现,Nrf2在巨噬细胞中可抑制一系列促炎因子的表达,如诱导型一氧化氮合成酶(iNOS),单核细胞趋化蛋白1(MCP-1),巨噬细胞炎症蛋白1β(MIP-1β),而这一过程中几乎不影响NF-κB信号通路的水平。与此同时,我们还发现Nrf2可以抑制白介素1p(IL-1β),白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎性因子的表达水平。上述两方面结果暗示,西洋参在巨噬细胞中对抑制炎症的作用,有可能是因为其中的某些组分是Nrf2的类似物或激动剂,具有激活Nrf2,从而抑制炎性反应的功效。基于上述研究,我们认为,在治疗心血管系统疾病时,西洋参的保护作用来源于Nrf2的激活,在西洋参中寻找激动Nrf2的单一化合物,找出新的Nrf2激动剂将有利于心血管疾病的预防和治疗。因此,本文试图寻找分离出西洋参中的其他有效成分,并最终发现西洋参醇可以特异性激动Nrf2,且在抑制炎性反应、保护心肌细胞死亡和肥大方面效果显著,可以成为预防和治疗心血管疾病的新的治疗药物。研究目的：1.建立西洋参提取物刺激RAW264.7炎性细胞的有效体系,即寻找各组分的最大安全剂量。2.筛查西洋参对LPS诱导的炎症存在抑炎作用的有效组分。3.探讨西洋参有效组分是否对心肌细胞存在保护作用。4.探讨Nrf2在西洋参保护心肌细胞中所起的关键作用。研究方法：1.购入Nrf2基因敲除工具小鼠,保种并扩大繁殖。2.获得西洋参各个组分,包括粗提物、人参己烷提取物及人参醇等。3.培养RAW264.7、L929巨噬细胞、H9c2大鼠心肌细胞系,提取并培养小鼠原代骨髓细胞并诱导分化为巨噬细胞以进行实验研究。4.双荧光素酶报告基因检测ARE和Neh2转录活性。5.[3H]亮氨酸摄入实验检测心肌细胞肥大水平。6.免疫荧光和激光共聚焦检测Nrf2表达位置水平。7. Western blot检测蛋白表达。8. Q-PCR检测基因表达。9.应用SPSS统计软件进行单因素方差分析,P<0.05有统计学差异。结果：1.西洋参提取物各组分对RAW264.7细胞的毒性剂量通过LDH实验,西洋参粗提物(Am.G),人参己烷提取物(Hexane)、水提取物(Water)在5001μg/ml及更高剂量下出现细胞死亡,对细胞存在毒性；丁醇提取物(Butanol)在1000μg/ml有毒性；而其他提取物,如二氯甲烷提取物(Dichloromethane)、乙酸乙酯提取物(Ethyl acetate)及麦芽糊精提取物(Maltodextrin)在1000μg/m1浓度剂量以内均无毒。故西洋参提取物均采用对细胞无毒性的100μg/ml进行研究。2.西洋参部分组分有抑炎作用给予LPS刺激RAW264.7细胞同时给予各种西洋参提取物共同刺激,仅西洋参粗提物,西洋参己烷提取物及其进一步的提取物西洋参醇(0.5μM的安全剂量)存在抑炎作用,即给予该三种西洋参组分后,一氧化氮合成酶(iNOS)的蛋白表达较单纯给予LPS刺激6小时组显著性降低,而其他西洋参组分无此作用。3.西洋参粗提物、己烷提取物、醇提取物抑制炎性因子转录水平的表达LPS刺激RAW264.7细胞同时给予西洋参粗提物,己烷提取物以及醇提取物共同刺激,观察包括iNOS在内的炎性因子转录水平的表达。三种西洋参组分抑制细胞分泌iNOS,单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和巨噬细胞炎症蛋白1β(MIP-1p)；而三种组分对LPS诱导的白介素1p(IL-1p)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达在转录水平均没有抑制作用。4.西洋参粗提物,西洋参己烷提取物和西洋参醇均刺激Nrf2表达三种西洋参组分均可刺激Nrf2表达升高。在1,2,6小时时间点,Nrf2蛋白表达明显增加；西洋参刺激1,2小时,Nrf2下游基因NADPH：醌类氧化还原酶(NQO-1)转录水平上调；免疫荧光显示,三种组分处理后的细胞均表达Nrf2,并绝大多数定为在细胞核内。双荧光素酶报告基因检测Nrf2下游基因抗氧化反应元件(ARE)和Nrf2-ECH同源结构域(Neh.2)活性,发现该三种组分不同程度激活ARE和Neh2。5.Nrf2敲除小鼠的巨噬细胞中iNOS表达水平不随西洋参各组分刺激而下降将小鼠的骨髓原代细胞诱导为巨噬细胞后,给予LPS与西洋参各组分同时刺激,野生型小鼠原代巨噬细胞对各组的反应与RAW264.7细胞一致,即同时给予LPS与西洋参粗提物或西洋参醇后,iNOS的表达较单独给予LPS组为低,西洋参对抑炎的作用同时在转录水平与蛋白表达水平得到证实；而在Nrf2基因敲除小鼠的巨噬细胞中,西洋参各组分的抑炎作用消失,即LPS组与LPS-西洋参同时刺激组中的iNOS水平无统计学差异。6.经西洋参提取物预处理的RAW264.7条件培养基对心肌起保护作用收集经LPS,西洋参粗提物,己烷提取物,醇提取物或LPS与西洋参各组分同时刺激RAW264.7细胞48小时后的培养基,与新鲜培养基按比例制成条件培养基。LDH实验证实,西洋参三种组分均可保护H9c2细胞死亡。单独给予西洋参各组分而未同时刺激LPS的条件培养基与溶剂对照组相比,即可一定程度抑制心肌细胞死亡,而同时给予LPS刺激后,西洋参各组分对心肌细胞死亡的保护作用明显增加。类似,用同批次得到的条件培养基刺激H9c2细胞,检测[3H]亮氨酸掺入率,即观察细胞肥大水平。结果显示单独给与西洋参各组分而未同时刺激LPS的条件培养基相较于溶剂对照组,[3H]亮氨酸掺入减少,抑制心肌细胞肥大,而同时给予LPS刺激后,西洋参各组分的保护作用明显增加,相较于LPS组,[3H]亮氨酸掺入显著减少,明显抑制心肌发生肥大。7.Nrf2沉默后RAW264.7细胞条件培养基对心肌的保护作用RAW264.7细胞分别转染Nrf2小干扰RNA及其乱序对照(Nrf2 siRNA和Ctr siRNA),再同时刺激LPS与西洋参粗提物、己烷提取物或醇提取物,收集并制成条件培养基。Q-PCR结果和双荧光素酶报告基因ARE检测均证实Nrf2的表达被明显抑制,敲除效率高。将有效敲除Nrf2的RAW264.7细胞条件培养基刺激H9c2细胞,观察细胞死亡情况,LDH实验证实,乱序干扰组中LPS与西洋参粗提物、己烷提取物、醇提取物同时刺激与LPS组相比,均可保护心肌死亡。而敲掉Nrf2后的LPS与西洋参各组分同时刺激的条件培养基,对心肌死亡的保护作用消失。类似,用同批次得到的条件培养基刺激H9c2细胞,检测[3H]亮氨酸掺入率,即观察细胞肥大水平。结果显示乱序对照组结果与前期数据一致,即LPS与西洋参粗提物,己烷提取物或醇提取物同时刺激与LPS组相比,[3H]亮氨酸掺入减少,抑制心肌肥大,而Nrf2敲除后,无论给予何种LPS和西洋参提取物,[3H]亮氨酸掺入率未发生明显的改变。结论：1.西洋参中西洋参粗提物,西洋参己烷提取物与西洋参醇提取物均可抑制炎性细胞表达特定炎性因子。2.西洋参粗提物,西洋参己烷提取物与西洋参醇提取物可保护炎性浸润导致的心肌死亡与心肌肥大。3.三种西洋参提取物可激活炎性细胞内Nrf2的表达。4.Nrf2敲除后西洋参醇对心肌细胞的保护作用消失。5.西洋参醇对心肌细胞死亡和心肌肥大的保护作用是通过激活Nrf2并依赖Nrf2完成的。研究背景皮肤的创伤愈合过程，是皮肤全层不同细胞和体液内微环境相互作用的复杂过程，按时间顺序大致经过以下几个阶段：生长因子释放，炎性反应，血管新生，细胞增殖，上皮再生以及重塑阶段。这几个阶段相互重叠，共同作用，完成创伤愈合的整个过程。早期阶段炎性细胞的趋化作用为后期血管新生，细胞增殖，结构重塑等都起到了至关重要的作用；而血管新生同样在皮肤愈合中，为局部组织提供营养发挥重要的作用。在创伤发生的初始阶段，胶原纤维附着于创面以利于血液凝固，与此同时，细胞分泌释放强效血管收缩因子促进凝血，血凝块中主要含有胶原纤维，血小板，凝血酶，纤维连接蛋白以及介导炎性反应的多种细胞因子和生长因子。在损伤后的24-48小时内，由于受到白介素1(IL-1)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)等多种细胞因子的刺激，附近组织和血液中的单核细胞首先聚集到创面，转化成巨噬细胞。中性粒细胞随后到达创伤区域，吞噬入侵的细菌及死亡的细胞碎片。充分的炎性细胞浸润尤其是巨噬细胞募集有助于组织从炎性反应阶段向细胞增殖阶段过渡。皮肤的血管新生过程中，成血管细胞向内皮细胞分化，形成实心血管束，而后形成血管腔，最后根据需要分化成动脉或静脉。血管新生主要分为以下几个阶段。首先，在血管内皮生长因子(VEGF)的趋化诱导下，成熟血管的基底膜降解，率先突破血管层向外伸展的细胞称之为尖细胞(tip cell)，随后茎细胞(stalkcell)增殖延伸。其次，从血管层向外伸出的多个尖细胞相互接触，后者引导茎细胞增殖，生成新的密闭血管腔。最后，这些新形成的密闭的无序排列的血管腔在血流的作用下，进一步分化形成成熟的毛细血管网，完成血管重塑，为缺血组织提供养分，促进创伤愈合。自噬在生物种群内高度保守存在，通过与溶酶体结合降解细胞内的衰老蛋白质或细胞器，从而为细胞自身的存活提供营养来源。目前，根据降解途径不同，自噬可大致分为3类：巨自噬，微自噬和分子伴侣介导的自噬。前两种自噬无明显的选择性，而分子伴侣介导的自噬具有选择性。巨自噬(后文简称为自噬)，被认为是三种自噬中的最主要一种，在清除衰老的蛋白质和损伤的细胞器的过程中起主要作用，为维持细胞稳态起重要作用，也在饥饿状态下维持细胞生存起决定性作用。自噬十分敏感，在饥饿或其他刺激时，迅速产生大量自噬小体，聚集在内质网周围，但目前尚无证据显示内质网膜被直接用于自噬小体的形成。也有研究显示除内质网外的其他诸如高尔基体，线粒体以及细胞膜等有膜结构也参与自噬小体的形成。在营养供给正常的情况下，大多数衰老的蛋白质，细胞器以及不可溶的多聚蛋白成分由蛋白酶体系统降解，分解成氨基酸为细胞提供营养成分；而在血清饥饿条件下，自噬被启动，降解长寿蛋白质、可溶性错配蛋白质等为氨基酸成为细胞供养的主要途径。研究发现，氨基酸、生长因子、氧气以及能量的缺乏均可刺激自噬的发生。一系列蛋白质的参与自噬发生过程，并命名为自噬相关基因(Autophagy Related Gene，Atg)，其中起关键作用的基因至少有30余种，自噬高度保守的存在于包括哺乳动物在内的所有真核生物体内，其关键蛋白质相似，仅命名有所不同。在自噬整个过程中，Atg7协助形成Atg12-Atg5-Atg16L1复合体和帮助LC3从LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ的转化：1.ATP将Atg7活化后，具有E1泛素激活酶的作用，可与Atgl2结合，协助Atg12与E2泛素结合酶Atg10相结合，并最终将Atg12与Atg5相连接，并结合Atg16，形成Atg12-Atg5-Atg16L1多聚体，辅助Atg8(LC3)行使其功能；2，Atg8被Atg7激活后可转移到E2泛素结合酶Atg3上，并最终使Atg8带有磷脂酰乙醇胺(LC3 Ⅱ)使双层膜不断向外延伸。Atg7作为E1泛素激活酶，参与Atg12-Atg5-Atg16L1复合体和LC3 Ⅱ的成熟，在自噬小体延伸和成环过程中起不可替代的作用。尽管之前的文章已有文献报道，在内皮细胞中，抑制血管新生可激活自噬和诱导细胞凋亡；在内皮细胞中敲除Beclin1自噬起始过程中的关键基因可以促进缺氧诱导的血管新生；通过Ery5激活内皮细胞的自噬水平也可以抑制血管新生；血清饥饿或Atg5过表达激活自噬水平可以促进血管新生。然而，在某些病理条件下，过度自噬本身也对细胞造成损伤，自噬在内皮细胞中发挥了何种作用，自噬在血管新生中的具体机制均有待进一步研究。本文试图在小鼠皮肤愈合过程，探讨Atg7内皮细胞特异性敲除对炎性细胞浸润，血管新生各阶段产生的影响及其潜在机制。研究目的：1．获得并鉴定Atg7内皮特异性敲除小鼠。2．小鼠皮肤创伤模型的建立与分析。3．探讨影响Atg7内皮特异性敲除基因型小鼠创伤愈合速率的机制。研究方法：1．购入Floxed-Atg7F/F和Cdh5-Cre+/+；两种工具型小鼠，分别保种并扩大繁殖，得到Atg7内皮细胞特异性敲除的小鼠。2．Western blot检测蛋白表达，鉴定小鼠Atg7敲除效率。3．ImageJ软件分析小鼠皮肤创伤愈合情况。4．H&E染色观察小鼠创缘上皮细胞爬行情况及肉芽组织新生等。5．免疫组化检测目的蛋白表达水平。6．[3H]胸腺嘧啶摄入实验检测内皮细胞增殖水平。7．应用SPSS统计软件进行单因素方差分析，P<0.05有统计学差异。结果：1．获得并鉴定Atg7内皮特异性敲除小鼠将购得的两种基因型小鼠(Floxed-Atg7F/F和Cdh5-Cre+/+)适应性喂养一周后，相互交叉配对，得到第一代双基因杂合子(Atg7F/+；Cre+，即Atg7EC+/-)，将所得到的同窝双基因杂合子进行自交，通过基因鉴定可得到实验所需的所有基因型，野生型(wide type，即WT)，纯合子(Atg7F/F；Cdh5-Cre+，即Atg7EC-/-)，以及两种工具小鼠Agt7F/F和(Cre+)小鼠。将基因鉴定后的WT，Atg7EC+/+，Atg7EC-/-三种基因型的小鼠提取肺内皮细胞，其Atg7的蛋白表达水平在杂合子和纯合子内呈递减趋势，且总量均少于野生型小鼠。与此同时，杂合子和纯合子小鼠LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ的转化能力下降。综上所述，Atg7内皮特异性敲除小鼠体内Atg7表达水平下降确实，且体内内皮细胞自噬水平受到影响。2．小鼠四种基因型不改变体内主要脏器的大体型态正常喂养环境下，Atg7内皮特异性敲除对小鼠内皮细胞表达丰富的脏器无明显影响。研究发现，四种转基因型小鼠在以胸主动脉，颈总动脉为主的含有内皮细胞的血管中，血管组织内皮细胞完整，内膜光滑，大体形态相似；在毛细血管丰富的肺脏和肾脏中，脏器大体形态相似，组织学结构完整。Atg7基因敲除在正常喂养条件下不引起小鼠循环系统和其他内皮丰富的脏器的形态学改变。3．比较三种对照小鼠皮肤创伤愈合速率小鼠背部进行皮肤创伤模型，皮肤创缘照片显示，野生型小鼠与Cre工具小鼠的创伤愈合速率基本相似，第1，2，3，8，10天时，创面未愈合的面积与自身创伤的初始面积的比值，无统计学差异，而含有Flox位点的工具小鼠的创伤愈合速率较野生型和Cre工具鼠为慢，且自第1天开始至第10天，Atg7F/F小鼠的创伤面积均大于WT小鼠和Cre工具鼠。因此，既然Atg7F/F小鼠本身即对小鼠皮肤创伤愈合有影响，故应以该基因型作为对照组进行下一步实验与结果分析，比对含有Cdh5-Cre+的Atg7F/-(Atg7EC-/-)型小鼠的创伤愈合速率。4．Atg7EC-/-的小鼠的皮肤愈合速率快于Atg7FIF对照小鼠与Atg7F/F小鼠相比，Atg7EC-/-小鼠的创伤面积显著减小，其愈合速率加快。以第10天为例，Atg7F/F小鼠的创伤面积尚余30%，而Atg7EC-/-小鼠的创伤面积仅仅剩余15%。5．Atg7EC-/-和Atg7F/F小鼠的创伤部位皮肤形态学分析小鼠皮肤创伤手术第3天，统计箭头所示的上皮爬行距离与上皮细胞间隙，结果显示，Atg7F/F小鼠的平均上爬行距离为1.30mm，而Atg7EC-/-小鼠的仅为0.89mm，P值小于0.01；上皮细胞间隙Atg7F/F小鼠平均为2.57mm，而Atg7EC-/-小鼠仅为1.34mm;肉芽组织新生面积均在2mm2以上，且无显著性差异。6．Atg7内皮特异性敲除对皮肤血管新生的影响小鼠皮肤全层创伤10天后，正值血管形成的高峰期，Atg7EC-/-和Atg7F/F两种基因型小鼠皮肤组织内的CD31阳性细胞占所有细胞的比值均在20%左右，无统计学差异。原代培养人脐静脉内皮细胞，干扰Atg7 siRNA后，观察细胞增殖效率，两组细胞的[3H]胸腺嘧啶掺入率无统计学差异。故小鼠创伤愈合的速率与小鼠的内皮细胞增殖和血管新生无关，Atg7在内皮中被特异性敲除并不影响小鼠皮肤中的血管新生速率。7．Atg7EC-/-和Atg7F/F小鼠的创伤部位炎性细胞的表达创伤第3天，在皮肤肉芽组织与皮肤形态正常的组织的交界处，巨噬细胞(Mac2)和T细胞(CD3)在Atg7Ec4-小鼠中聚集增加，分别占所有细胞的49.1%和2.5%，而Atg7F/F小鼠中的巨噬细胞(Mac2)和T细胞(CD3)表达分别为39.6%和1.5%，差异有统计学意义。说明Atg7基因敲除引起炎症反应适度增加，清除坏死组织速率增加，有利于上皮细胞爬行区域下的肉芽组织向正常组织过度，从而促进创伤愈合。结论：1．Atg7内皮特异性敲除小鼠建模成功，内皮细胞中Atg7表达降低，自噬功能受损。但小鼠在正常饲养条件下，内皮细胞丰富的脏器大体形态正常。2．Atg7F/F转基因小鼠自身影响皮肤创伤愈合，作为对照与Atg7EC-/-小鼠比较愈合速率。3．Atg7EC-/-转基因小鼠创伤愈合速率快于Atg7F/F小鼠。4．Atg7内皮特异性敲除不影响皮肤组织内血管新生，体外增殖实验证实[3H]胸腺嘧啶掺入率水平不受Atg7敲除的影响。5．皮肤创伤愈合早期，Atg7EC-/-小鼠皮肤组织内巨噬细胞和T细胞浸润增加，是促进皮肤愈合的原因。