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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪和生长育肥猪呼吸道症状和高死亡率为特征的猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。尽管对PRRSV致病机制进行了广泛的研究，取得了一系列有重要意义的成果，但在病毒的感染机制及与宿主细胞的相互作用机制等方面，人们还知之甚少，是近年来的研究热点。本研究主要针对PRRSV感染后诱导细胞产生自噬反应的分子机制进行了深入探讨，系统分析了PRRSV与细胞自噬的相互作用机制。主要研究内容包括: 1.PRRSV感染引起MARC-145细胞产生自噬现象 应用透射电子显微技术、共聚焦免疫荧光技术，免疫印迹(WesternBlot)分析，对感染PRRSV的细胞的自噬水平进行定性和定量分析。透射电镜可以观察到感染PRRSV的细胞胞浆近核区双膜自噬体样结构显著增多;感染PRRSV的细胞内LC3呈点状分布，且与PRRSV非结构蛋白NSP2共定位，表明自噬可能参与到PRRSV的复制;WesternBlot检测到细胞内LC3-Ⅱ分子的水平随着病毒复制不断增加;结果表明，PRRSV感染可以诱导MARC-145细胞产生自噬。而紫外线UV灭活的病毒不能引起细胞自噬的活化。这些结果表明，PRRSV的感染复制与细胞自噬密切相关。 2.细胞自噬影响PRRSV的复制 我们通过自噬药物调节剂及shRNAs干扰技术，改变MARC-145细胞的自噬活性，再感染PRRSV，测定PRRSV滴度，检测分析细胞自噬对病毒复制的影响。结果表明，自噬诱导剂rapamycin可以提高MARC-145细胞自噬水平，细胞内N蛋白的表达量及细胞上清子代病毒的滴度明显增加;相反，利用自噬抑制剂3-MA降低细胞自噬水平后，MARC-145细胞内病毒N蛋白的表达量及细胞上清子代病毒的滴度显著降低。同样，干扰自噬基因ATG5和LC3B抑制细胞自噬，细胞内病毒N蛋白的表达量及细胞上清子代病毒量显著降低。这些结果表明细胞自噬可以促进PRRSV在MARC-145细胞的复制。我们利用流式细胞术检测了高浓度药物rapamycin(500nM)和3-MA(20mM)处理对PRRSV入胞的影响，并检测了药物处理细胞及自噬基因缺失细胞其上清乳酸脱氢酶LDH含量变化以检测药物及干扰处理的细胞毒性。结果表明，自噬调节药物并不影响细胞的病毒的入胞;自噬调节药物处理细胞及自噬基因缺失细胞其上清乳酸脱氢酶LDH含量与对照组细胞没有明显变化，表明该处理影响病毒复制并不是通过其细胞毒性及影响病毒入胞。 3.细胞自噬为猪繁殖与呼吸综合征病毒复制提供位点 确定细胞自噬可以促进病毒复制的基础上，我们进一步研究了PRRSV引起的自噬体特性，研究发现在PRRSV诱导产生的自噬体，其标志分子LC3不能完全与溶酶体的标志分子LAMP1及染料Lysotracker特异性标记的溶酶体结构共定位;通过转染双荧光质粒GFP-RFP-LC3，在PRRSV感染的细胞内双阳性的GFP和RFP蛋白可以共定位，而在没有感染PRRSV的细胞内则主要为红色RFP-LC3蛋白为主;溶酶体抑制药物CQ也没有进一步的改变溶酶体对LC3-Ⅱ蛋白的降解，所有这些结果表明，PRRSV引起的自噬体与溶酶体的融合受到抑制。病毒蛋白NSP2及dsRNA能够与自噬体标志分子LC3-Ⅱ共定位，说明PRRSV复制复合体可能利用了自噬体结构;通过密度梯度离心初步分离纯化病毒复制复合体并进行westernblot验证了PRRSV复制成分与自噬体标志分子LC3-Ⅱ及ER标志分子PDI的共密度梯度组分，结果表明，PRRSV感染抑制了自噬体与溶酶体的融合，从而利用自噬体结构作为自身复制的膜结构，促进了病毒的增殖。 4.猪繁殖与呼吸综合征病毒通过mTOR通路影响自噬 自噬体的诱导具有严格的细胞信号通路调控，在本研究中我们首先检测了在自噬中具有重要调节作用的激酶的变化并通过药物特异性抑制信号通路中各个激酶活性，研究其在PRRSV感染诱导的MARC-145细胞自噬中所起的作用。结果表明，在PRRSV感染的MARC-145细胞中，mTORC1活性受到抑制导致自噬活化增强，mTOR下游信号通路蛋白P70S6K和4E-BP1的磷酸化水平降低进一步验证了mTORC1活性受到抑制;mTOR上游激酶PI3K抑制剂LY294002和rapamycin可以抑制mTOR的磷酸化而增强细胞的自噬水平进一步表明mTOR在PRRSV诱导引起的自噬中的作用。AMPK在PRRSV感染后磷酸化水平增加，通过抑制剂CompoundC抑制酶活后，自噬水平没有受到影响，说明虽然AMPK磷酸化水平的增加在PRRSV诱导引起的自噬中可能不起作用。 5.UPR与自噬的关系研究 病毒感染引起的UPR在自噬的诱导发生过程中发挥重要作用。在本研究中，我们检测比较了在PRRSV感染的MARC-145细胞和ERstress诱导剂衣霉素TU处理细胞内UPR信号通路PERK、eIF2α及JNK的磷酸化水平及XBP1的剪切，结果显示，PRRSV感染分别在4hpi和6hpi引起了PERK通路PERK及其下游eIF2α磷酸化增强，与PRRSV诱导引起的自噬趋势一致;XBP1的剪切水平在8hpi开始出现，JNK的磷酸化水平也显著增加;这些结果表明，PRRSV可以引起MARC-145细胞内IRE1α/XBP1和PERK两条UPR信号通路的活化。通过对IRE1α基因进行干扰敲除，我们分析了UPR在PRRSV诱导引起的自噬中的作用，结果表明，干扰IRE1α基因可以明显抑制细胞自噬水平，和细胞内调节自噬激酶AKT和mTOR的磷酸化水平，证明IRE1α可以通过影响AKT/mTOR通路影响自噬产生。