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研究目的:反复短暂的大强度间歇性有氧运动,能够提高心肌耐受缺血缺氧的能力,减轻随后长时间缺血缺氧所致的心肌损伤,这种通过运动诱导机体产生内源性心肌保护效应的方式称为运动预适应(exercise preconditioning,EP)。细胞自噬是将细胞内异常蛋白质和衰老、损伤细胞器降解再利用的生理过程,当能量缺乏、缺血缺氧和氧化应激等刺激时,自噬被激活或增强,是维持细胞稳态的内源性保护机制。目前,EP心肌保护效应及机制的研究成果不胜枚举,细胞自噬参与EP心肌保护效应的机制研究也有很多报道,但仍有许多科学问题有待更深入探讨。本研究以细胞自噬为切入点,进一步验证EP对运动性心肌缺血缺氧损伤的保护效应,并比较HE、HBFP和C-2R BG三种染色技术的应用特点,通过研究自噬诱导相关蛋白Beclin1/Bcl-2、Beclin1/LC3的变化,研究自噬体形成相关蛋白Atg12-Atg5、Atg16L1的变化,探讨EP诱导细胞自噬和促进自噬体形成的可能机制,为EP心肌保护效应及机制的研究提供更新的理论和实验依据。研究方法:健康雄性SD大鼠120只,随机分为6组,每组20只,即对照组(C组);早期运动预适应组(EEP组);晚期运动预适应组(LEP组);力竭运动组(EE组);早期运动预适应+力竭组(EEP+EE组);晚期运动预适应+力竭组(LEP+EE组)。(1)用心电图记录大鼠心电活动,通过ST段和T波的变化分析各组大鼠心肌缺血缺氧的情况。(2)血浆心肌损伤标志物检测,用化学发光免疫分析法检测血浆c Tn I含量,用酶联免疫吸附法检测血浆H-FABP含量。(3)用HE、HBFP和C-2R BG染色显示心肌组织缺血缺氧改变,并通过相邻切片对比三种染色特点。(4)用透射电镜观察心肌细胞超微结构和自噬体。用心电图、血浆心肌损伤标志物和心肌组织形态学指标,综合评价心肌损伤与保护的程度。(5)用免疫荧光双标技术,通过激光共聚焦扫描显微镜观察心肌组织Beclin1/Bcl-2、Beclin1/LC3和Atg12-Atg5/Atg16L1的表达变化,并分析共定位程度。(6)用免疫印迹实验检测心肌组织Atg12-Atg5和Atg16L1的表达变化。(7)用免疫共沉淀实验分析心肌组织Atg12-Atg5和Atg16L1的相互关系。研究结果:(1)心电图显示,与C组相比,EEP组和LEP组心电图波形未见异常,EE组ST段显著高抬(P<0.05),T波显著高耸(P<0.05);与EE组相比,EEP+EE组和LEP+EE组ST段和T波明显回落(P<0.05)。(2)血浆心肌损伤标志物含量检测显示,与C组相比,EE组血浆c Tn I和H-FABP含量显著升高(P<0.05);与EE相比,EEP+EE组和LEP+EE组血浆c Tn I和H-FABP含量显著降低(P<0.05)。(3)心肌组织缺血缺氧染色显示,与C组相比,EE组心肌组织缺血缺氧程度明显加重;与EE组相比,EEP+EE组和LEP+EE组心肌组织缺血缺氧程度明显减轻。三种染色比较,缺血缺氧部位基本一致,与HE染色相比,HBFP和C-2R BG染色对缺血缺氧具有特异性,染色结果对比度明显。(4)透射电镜显示,C组心肌细胞,肌原纤维排列整齐;线粒体呈球形或短棒状,电子密度均一,均匀分布于肌原纤维之间;细胞核核膜完整平滑,染色质分布均匀。EE组心肌细胞肌原纤维排列紊乱,肌丝断裂溶解;线粒体水肿,基质变稀,电子密度明显下降,可见成空泡样改变;细胞核可见核膜内陷,但染色质分布均匀,未见核固缩以及核崩解。与EE组相比,EEP+EE组和LEP+EE组心肌超微结构有明显改善。在EEP组、LEP组和LEP+EE组中均观察到典型的自噬体,且LEP+EE组自噬体中可见包裹有大量待降解底物。(5)免疫荧光双标,Beclin1和Atg12-Atg5显示为红色荧光,Bcl-2、LC3和Atg16L1显示为绿色荧光,Beclin1/Bcl-2、Beclin1/LC3和Atg12-Atg5/Atg16L1的共定位显示为黄色荧光;共定位分析显示,与C组相比,其余各组大鼠心肌组织Beclin1/Bcl-2共定位程度均显著降低(P<0.05),EEP组、EE组、EEP+EE组和LEP+EE组Beclin1/LC3和Atg12-Atg5/Atg16L1共定位程度均显著升高(P<0.05);与EE组相比,EEP+EE组心肌组织Beclin1/LC3和Atg12-Atg5/Atg16L1共定位程度显著升高(P<0.05)。(6)免疫印迹显示,与C组相比,EEP组、LEP组和EEP+EE组Atg12-Atg5表达显著升高(P<0.05);EEP组和EEP+EE组Atg16L1表达显著升高(P<0.05);与EE组相比EEP+EE组Atg12-Atg5和Atg16L1表达均显著升高(P<0.05)。(7)免疫共沉淀显示,各组大鼠心肌组织Atg12-Atg5和Atg16L1均存在结合关系。研究结论:EP能够明显降低力竭运动导致的大鼠心电图ST段抬高和T波高耸,降低血浆心肌损伤标志物含量,减轻心肌组织缺血缺氧程度,进一步证实了EP对运动性心肌缺血缺氧损伤具有保护效应。HE、HBFP和C-2R BG三种染色均可用于显示心肌组织缺血缺氧改变,HBFP和C-2R BG染色对缺血缺氧具有特异性,染色结果对比度明显易于图像处理。EP能够明显降低心肌组织Beclin1/Bcl-2的共定位程度,减少Beclin1/Bcl-2的结合,提示游离Beclin1水平升高,诱导心肌细胞自噬;并促进Beclin1/LC3共定位程度增加,提高自噬活性。EP能够使心肌组织自噬体形成相关蛋白Atg12-Atg5和Atg16L1表达升高,使两者相互作用增强,共定位程度增加,并且在EEP组、LEP组和LEP+EE组观察到典型的自噬体,提示EP能够诱导细胞自噬促进自噬体形成参与内源性心肌保护效应。