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核盘菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary]是一种重要的植物病原真菌，可以引起多种经济作物菌核病，造成严重的经济损失。生防菌盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌的一种专性重寄生真菌。草酸是核盘菌分泌的重要致病因子，具有酸性、还原性和螯合钙离子等特性。前期研究发现：在盾壳霉与核盘菌互作过程中，核盘菌分泌的草酸能诱导盾壳霉产生草酸脱羧酶CmOxdc1，同时产生抗真菌物质来拮抗核盘菌。当草酸被CmOxdc1降解后，环境pH值升高，盾壳霉会通过CmpacC信号通路来激活重寄生相关酶(如几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶等)基因的表达，从而寄生核盘菌。这说明草酸在盾壳霉与核盘菌互作过程中发挥重要作用。但是，盾壳霉响应草酸的分子机制还知之甚少。因此，本研究对盾壳霉响应草酸进行了转录组分析，筛选到1个新的草酸脱羧酶基因CmOxdc3和1个Ca2+信号通路转录因子CmCRZ，采用基因敲除和回补等技术研究了这两个基因的功能，另外还对调控氧化还原平衡的bZIP基因家族进行了分析，旨在解析盾壳霉响应草酸的分子机制。研究结果如下：
1.盾壳霉接触草酸(24 mM)不同时间点(0h、20 min、1 h、3 h、6 h、9 h)的转录组分析结果表明：有92个基因在接触草酸后5个时间点内均显著下调表达，有165个基因在接触草酸后5个时间点内均显著上调表达。这些差异表达基因主要富集在氧化还原平衡、Ca2+信号通路、细胞增殖和有机物代谢等通路，它们可能在响应草酸胁迫过程中发挥重要作用。
2.从转录组差异表达基因中筛选到一个新的草酸脱羧酶基因CmOxdc3，比较分析了CmOxdc3与CmOxdc1的表达模式和基因功能。RT-qPCR结果显示，CmOxdc3仅受草酸、丙二酸、盐酸诱导上调表达，而CmOxdc1可以受多种酸诱导上调表达。草酸降解试验结果表明，CmOxdc3在降解高浓度(24 mM)草酸时发挥关键作用，而CmOxdc1在降解低浓度(12 mM)草酸时起主要作用。CmOxdc3的敲除导致盾壳霉对核盘菌菌核的重寄生能力显著下降。亚细胞定位观察发现CmOxdc3定位于细胞质，草酸刺激后，CmOxdc3定位于液泡。酵母分泌系统试验证实CmOxdc1的信号肽具有分泌性。这说明CmOxdc3主要在胞内降解草酸，而CmOxdc1则是分泌到胞外降解草酸。
3.由于草酸能螯合钙离子，核盘菌分泌的草酸可能会影响盾壳霉Ca2+信号通路。因此，我们分析了盾壳霉Ca2+信号通路转录因子CmCRZ基因在盾壳霉响应草酸过程中的作用。CmCRZ的敲除导致盾壳霉菌丝生长缓慢、菌落边缘畸形、产孢量显著降低、黑色素形成减少、重寄生能力显著下降。CmCRZ敲除突变体对草酸胁迫更耐受，且低浓度(8 mM)草酸能恢复其表型。酸碱敏感性测定发现，CmCRZ敲除突变体对酸性环境更耐受，而对碱性环境更敏感。CmCRZ的敲除导致盾壳霉活性氧清除相关基因显著下调表达，菌丝胞内H2O2水平显著升高，对氧化剂(H2O2和VK3)耐受性增强，且胞外氧化性物质分泌显著增多。CmCRZ敲除突变体与核盘菌对峙培养时会形成拮抗带，而添加抗氧化剂Vc可以减小拮抗带宽度，调节至酸性环境(pH 4)则拮抗带消失。这说明拮抗带可能是因为CmCRZ敲除导致盾壳霉生长缺陷，分泌大量氧化物所造成的。金属离子敏感性测定表明，CmCRZ敲除突变体对Na+、Ca2+和Mn2+更敏感，而Mg2+则可以恢复突变体的生长和产孢。以上结果表明CmCRZ基因参与调控了盾壳霉的生长、产孢、氧化还原平衡、pH感应、Ca2+信号、以及抗生和重寄生等过程。
4.草酸作为一种还原剂，可能会改变盾壳霉的胞内氧化还原平衡。我们对调控氧化还原平衡的bZIP基因家族进行了分析，发现盾壳霉一共含有34个bZIP基因，其bZIP结构域中内含子插入位点具有很高的保守性。CmbZIP基因在响应草酸胁迫和其他非生物胁迫，以及产孢过程中均存在显著的差异表达。对4个差异表达的bZIP基因进行了敲除，其中3个CmbZIP基因(CmbZIP07、CmbZIP09和CmbZIP13)的敲除对盾壳霉的生长、产孢和响应草酸胁迫均没有显著影响。而CmbZIP16的敲除显著增强了盾壳霉对H2O2的敏感性，说明CmbZIP16在响应氧化胁迫时发挥重要作用。
综上所述，本研究鉴定了一个新的草酸脱羧酶基因CmOxdc3的功能，发现其主要起降解胞内草酸的作用。明确了Ca2+信号通路转录因子CmCRZ基因的功能，发现CmCRZ在盾壳霉与核盘菌互作过程中扮演重要角色。对盾壳霉bZIP基因家族进行了分析，证实CmbZIP16能响应氧化胁迫。本研究加深了对盾壳霉响应草酸分子机制的认识，为全面揭示盾壳霉-核盘菌互作分子机制奠定了基础。
1.盾壳霉接触草酸(24 mM)不同时间点(0h、20 min、1 h、3 h、6 h、9 h)的转录组分析结果表明：有92个基因在接触草酸后5个时间点内均显著下调表达，有165个基因在接触草酸后5个时间点内均显著上调表达。这些差异表达基因主要富集在氧化还原平衡、Ca2+信号通路、细胞增殖和有机物代谢等通路，它们可能在响应草酸胁迫过程中发挥重要作用。
2.从转录组差异表达基因中筛选到一个新的草酸脱羧酶基因CmOxdc3，比较分析了CmOxdc3与CmOxdc1的表达模式和基因功能。RT-qPCR结果显示，CmOxdc3仅受草酸、丙二酸、盐酸诱导上调表达，而CmOxdc1可以受多种酸诱导上调表达。草酸降解试验结果表明，CmOxdc3在降解高浓度(24 mM)草酸时发挥关键作用，而CmOxdc1在降解低浓度(12 mM)草酸时起主要作用。CmOxdc3的敲除导致盾壳霉对核盘菌菌核的重寄生能力显著下降。亚细胞定位观察发现CmOxdc3定位于细胞质，草酸刺激后，CmOxdc3定位于液泡。酵母分泌系统试验证实CmOxdc1的信号肽具有分泌性。这说明CmOxdc3主要在胞内降解草酸，而CmOxdc1则是分泌到胞外降解草酸。
3.由于草酸能螯合钙离子，核盘菌分泌的草酸可能会影响盾壳霉Ca2+信号通路。因此，我们分析了盾壳霉Ca2+信号通路转录因子CmCRZ基因在盾壳霉响应草酸过程中的作用。CmCRZ的敲除导致盾壳霉菌丝生长缓慢、菌落边缘畸形、产孢量显著降低、黑色素形成减少、重寄生能力显著下降。CmCRZ敲除突变体对草酸胁迫更耐受，且低浓度(8 mM)草酸能恢复其表型。酸碱敏感性测定发现，CmCRZ敲除突变体对酸性环境更耐受，而对碱性环境更敏感。CmCRZ的敲除导致盾壳霉活性氧清除相关基因显著下调表达，菌丝胞内H2O2水平显著升高，对氧化剂(H2O2和VK3)耐受性增强，且胞外氧化性物质分泌显著增多。CmCRZ敲除突变体与核盘菌对峙培养时会形成拮抗带，而添加抗氧化剂Vc可以减小拮抗带宽度，调节至酸性环境(pH 4)则拮抗带消失。这说明拮抗带可能是因为CmCRZ敲除导致盾壳霉生长缺陷，分泌大量氧化物所造成的。金属离子敏感性测定表明，CmCRZ敲除突变体对Na+、Ca2+和Mn2+更敏感，而Mg2+则可以恢复突变体的生长和产孢。以上结果表明CmCRZ基因参与调控了盾壳霉的生长、产孢、氧化还原平衡、pH感应、Ca2+信号、以及抗生和重寄生等过程。
4.草酸作为一种还原剂，可能会改变盾壳霉的胞内氧化还原平衡。我们对调控氧化还原平衡的bZIP基因家族进行了分析，发现盾壳霉一共含有34个bZIP基因，其bZIP结构域中内含子插入位点具有很高的保守性。CmbZIP基因在响应草酸胁迫和其他非生物胁迫，以及产孢过程中均存在显著的差异表达。对4个差异表达的bZIP基因进行了敲除，其中3个CmbZIP基因(CmbZIP07、CmbZIP09和CmbZIP13)的敲除对盾壳霉的生长、产孢和响应草酸胁迫均没有显著影响。而CmbZIP16的敲除显著增强了盾壳霉对H2O2的敏感性，说明CmbZIP16在响应氧化胁迫时发挥重要作用。
综上所述，本研究鉴定了一个新的草酸脱羧酶基因CmOxdc3的功能，发现其主要起降解胞内草酸的作用。明确了Ca2+信号通路转录因子CmCRZ基因的功能，发现CmCRZ在盾壳霉与核盘菌互作过程中扮演重要角色。对盾壳霉bZIP基因家族进行了分析，证实CmbZIP16能响应氧化胁迫。本研究加深了对盾壳霉响应草酸分子机制的认识，为全面揭示盾壳霉-核盘菌互作分子机制奠定了基础。