Dax1(Dosage-sensitive sex reversal-AHC-critical region on the X-chromosome gene1,NR0B1)为孤核受体家族成员,其结构和功能在人和小鼠中保守,是生殖发育、性别决定及激素生成等重要生理过程的关键调控基因。近来在肿瘤中的研究发现,Dax1在肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞中高表达,并与肿瘤的分级和预后密切相关。然而,Dax1在肿瘤中的具体功能和机制还并不清楚。肿瘤细胞具有快速增殖、自我更新和多向分化潜能,这些特性同胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)非常相似。肿瘤发生是癌基因异常表达导致正常细胞致瘤性转化的结果,其过程与体细胞重编程为诱导多能干细胞(Induced pluripontency stem cell,i PSC)的过程有诸多类似之处。此外,ESC和iPSC同高恶性度肿瘤样本具有相似的转录本特征,并且维持ESC多能性和自我更新的干性基因以及重编程因子,如Oct4、Nanog、Lin28、Klf4等通常在肿瘤中异常表达,并可导致正常细胞致瘤性转化,促进肿瘤的发生发展。因此,ESC和i PSC中的基因功能对研究肿瘤发生的机制而言,具有十分重要的参考价值和借鉴意义。蛋白质和基因组学研究发现,Dax1是以Oct4、Nanog为核心的ESC多能性转录调控网络中的重要成员。我们前期的研究证实,Dax1是维持ESC多能性稳定状态不可或缺的重要分子,它与Nanog协同作用,通过抑制ESC分化而维持其自我更新;在重编程后期,Dax1的表达是促使i PSC成熟并获得多能性必要条件。鉴于Dax1与肿瘤的密切关系,我们推测,Dax1在促细胞致瘤性转化中可能发挥重要作用。可变剪接是真核生物转录后调控的常见方式,通过对同一基因pre-m RNA的不同剪接方式,可产生具结构和功能差异的不同剪接体。最新的研究表明,同一个基因所编码的不同剪接体的功能相差显著,几乎可以认为它们是由不同的基因编码。因此对基因剪接体类型的分析是研究其功能的前提。基因组学分析显示,肿瘤发生过程中常涉及大规模的基因剪接方式改变,并产生异常剪接体类型,功能异常剪接体的表达也是诱导细胞转化的重要原因。虽然在睾丸、卵巢、胰腺等肿瘤中已发现Dax1的一个剪切体,但Dax1是否还存在其它新的剪接体类型以及它们在细胞致瘤性转化中的作用还有待阐明。基于上述分析,本研究首先对人Dax1(hDax1)的不同剪接体类型进行鉴定。在此基础上,分析其与肿瘤的相关性,并分别研究这些剪接体在诱导正常细胞致瘤性转化中的功能,最后对其可能的诱导转化机制进行初步探讨。本课题的主要研究内容和结果如下:1.hDax1新剪接体的鉴定1.1通过套式PCR分析16种人体组织c DNA样本,并对产物进行测序鉴定,我们发现人组织中存在8种hDax1剪接体,分别为hDax1L-1413、hDax1L-729、hDax1L-549、hDax1L-453、hDax1A-1203、hDax1A-603、hDax1A-519、hDax1A2-189,各剪接体的mRNA及氨基酸序列均存在较大差异,可翻译生成具有不同功能结构域的蛋白,在不同类型组织中各hDax1剪接体的表达和分布特异。Western blots检测证实hDax1剪接体在细胞中存在内源性表达。1.2间接免疫荧光染色结果显示hDax1各剪接体亚细胞定位不同,且具有细胞特异性;双荧光素酶报告载体分析和ChIP-q PCR检测显示hDax1各剪接体具有不同的转录抑制活性及DNA结合能力;蛋白质免疫共沉淀分析显示不同hDax1剪接体的蛋白结合能力也存在差异。提示hDax1各剪接体具有不同功能。2.hDax1剪接体与肿瘤的相关性分析2.1通过检测不同类型肿瘤细胞系中hDax1的表达情况,发现在肿瘤细胞系至少存在hDax1L-1413、hDax1L-729、hDax1A-1203、hDax1A-519四种剪接体类型,而在不同类型肿瘤细胞系中,各剪接体表达分布不同。2.2我们利用GEO公共数据库中肿瘤样本的基因表达谱芯片数据,分析不同来源正常和肿瘤组织中hDax1表达情况,发现与正常组织相比,hDax1在肺癌、黑色素瘤等多种类型肿瘤中表达上调,且与肺癌和黑色素瘤的预后呈负相关。随后我们对TCGA数据库中的RNA-seq数据的分析结果显示hDax1各剪接体在不同类型肿瘤组织中的分布不同。进一步对肺癌和黑色素瘤临床样本中hDax1剪接体的检测结果显示,在同类型肿瘤不同样本间,hDax1剪接体的表达分布也存在差异。提示不同hDax1剪接体可能参与不同类型肿瘤发生发展过程。2.3利用单细胞水平RT-PCR检测,我们分析了同一肿瘤细胞系的单个细胞中hDax1表达情况,发现hDax1各剪接体也存在异质性表达。提示不同hDax1剪接体在细胞中可能发挥不同功能。3.hDax1剪接体在诱导正常细胞致瘤性转化中的功能分析利用经典转化诱导模型NIH3T3构建hDax1各剪接体的稳定表达细胞系,通过对细胞形态、非锚定生长、增殖能力及成瘤性等细胞转化表型的分析,我们发现剪接体hDax1L-1413、hDax1A-1203、hDax1A-519、hDax1A2-189过表达可诱导NIH3T3出现转化细胞形态,获得非锚定生长能力,且具有裸鼠体内成瘤性。其中h DaxA-1203/NIH3T3和hDax1A2-189/NIH3T3细胞形成肿瘤体积较大,而hDax1L-1413/NIH3T3和hDax1A2-189/NIH3T3细胞具有更强的肿瘤起始能力,提示它们诱导细胞转化的恶性程度不同。增殖实验结果显示这四种剪接体无促增殖能力,表明它们诱导的转化为增殖非依赖性的。而剪接体hDax1L-729、hDax1L-549、hDax1L-453、hDax1A-603无明显促转化能力。4.hDax1剪接体诱导细胞致瘤性转化的机制分析利用基因表达谱芯片我们对hDax1各剪接体诱导正常细胞转化的机制进行初步分析,发现剪接体hDax1L-1413、hDax1A-1203、hDax1A-519、hDax1A2-189促细胞转化机制不同,其中hDax1L-1413主要通过活化小GTPase介导的信号通路;hDax1A-1203则主要引起HIF-1、SHH及MAPK通路失调;hDax1A-519主要影响HIF-1通路;而hDax1A2-189主要影响HIF-1、SHH及WNT通路。随后的qRT-PCR实验证实各细胞中以上通路相关分子的表达变化与芯片分析结果一致。综上所述,本研究分析并鉴定了hDax1的新剪接体,发现它们具有不同的结构及功能。在不同类型肿瘤组织和细胞中,hDax1各剪接体表达分布存在差异。通过对hDax1各剪接体在诱导细胞恶性转化中的功能研究,我们发现hDax1可作为一个新的癌基因,促使正常细胞转化并获得致瘤性。不同hDax1剪接体具有不同的促细胞转化能力及调控机制,提示在不同类型肿瘤发生中,hDax1各剪接体可能发挥了不同功能。新剪接体的发现让我们对hDax1分子有了全新的认识,而hDax1各剪接体在诱导细胞转化中的功能和机制分析则可为进一步揭示不同类型肿瘤的发生机理提供新线索,并为肿瘤的特异性诊断和治疗提供新的靶标。