苎麻木质素合成相关基因BnC3H-1的克隆、表达分析及原核表达

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本研究通过对苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)高通量转录组测序数据的生物信息,获得了苎麻香豆酸-3-羟化酶(BnC3H-1)基因cDNA序列,针对该序列设计特异引物,结合RT-PCR和RACE技术成功克隆出一个BnC3H-1基因cDNA的全长序列,命名为BnC3H-1,并提交Gen Bank,基因登录号为KY078743。对BnC3H-1进行生物信息学分析表明,BnC3H-1基因cDNA序列全长为1940 bp,包含一个完整的开放读码框1536bp,5’UTR 96 bp,3’UTR 308 bp,其编码推导蛋白质含有511个氨基酸,相对分子量大小为57.8 kDa,理论等电点为8.61。利用BLAST在线分析,结果显示该基因编码蛋白具有Phe-x-x-Gly-x-Arg-x-Cys-x-Gly保守结构域,这与其他物种C3H基因编码蛋白的结构域相同,均为P450 98A亚家族成员。RT-qPCR(Quantitative Real-time PCR)分析表明,BnC3H-1在苎麻不同时期的木质部和韧皮部均有表达,在木质部中表达相对较高。BnC3H-1在同一时期,不同部位中的表达丰度顺序是:木质部>韧皮部;BnC3H-1在不同时期,同一部位的表达丰度顺序是:成熟期>快速生长期>成熟后期。推测该基因可能在木质素单体形成以及木质素生物合成中起到一定作用。利用蛋白质表达载体pET-22b成功构建了BnC3H-1的原核表达重组质粒pET-22b-C3H,将pET-22b-C3H质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),最佳诱导温度为37℃,最佳诱导剂浓度为1mmol·L-1 IPTG,诱导表达出融合蛋白,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白大小约58 kDa,大小与预期相符。
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