抗菌肽是一类耐受高温、分子量小、抗菌范围广的多肽类物质,这种肽类物质多是由生物体在防御外来病原体侵害时由免疫系统产生的天然多肽。与传统抗生素相比,抗菌肽表现出更稳定和更广泛的抗菌活性。除了对细菌、真菌的抑制作用还能够抑杀一些病毒和原虫。由于其广谱的抑菌特性和不易使各种细菌产生抗药性等重要优点,得到越来越多学者和专家的关注。杂合抗菌肽,是通过基因合成技术将两种或多种不同类型的天然抗菌肽采用一定的设计原则拼接而成的新型抗菌肽。通过人为改造的方式可以调节其空间结构和理化性质,从而得到更适合应用的新型抗菌肽。蜂毒肽（Melittin）是一种碱性的阳离子多肽,抑菌活性极强,但同时具有溶血毒副作用。蜂毒肽C端正电荷区域氨基酸是与细胞膜作用的重要部分,α-螺旋结构是保持溶血活性的必要条件,但对抗菌活性影响不大,其螺旋结构的形成对于抑菌活性的影响较小,而对于其溶血活性影响较大。人体防御素是抗微生物和病毒类的一种抗菌肽,最早是在人的多形核中性粒细胞中发现的,它对于外来侵入体具有很好的抵抗作用,包括常见的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及病毒,同时不具有溶血活性,是先天免疫系统中抗微生物的第一道防线。本研究以蜂毒肽C端的15个aa与人体防御素（HNP-1）作为母体肽,在运用生物信息学软件预测其理化性质和分析结构功能的基础上,设计合成杂合肽-Me-HNP1。旨在获得一种即具有和蜂毒肽抗菌活性相似,同时其溶血毒性又远低于蜂毒肽的新型杂合抗菌肽。研究结果表明:选用毕赤酵母（Pichia pastoris）偏爱密码子,翻译出杂合抗菌肽Me-HNP1碱基序列,通过primer5.0软件设计其上下游引物,聚合酶链式反应（PCR）扩增得到杂合抗菌肽Me-HNP1基因。将得到的杂合抗菌肽Me-HNP1基因与载体p PICZαA连接,获得重组表达载体p PICZαA-Me-HNP1。经过Eco R I/Not I双酶切和PCR扩增及DNA测序鉴定,证明真核表达载体p PICZαA-Me-HNP1已成功构建。通过电击转化的方式将单酶切后的线性化质粒p PICZαA-Me-HNP1转入到GS115毕赤酵母细胞内,再以含有Zoecin的培养基中筛选出含有重组表达载体p PICZαA-Me-HNP1的酵母菌株,于BMMY培养基中,利用甲醇作为诱导剂进行诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化处理和Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳检测,检测结果显示,约在5.0 KD处有一条清晰的蛋白条带,说明毕赤酵母中成功表达了Me-HNP1基因。优化重组毕赤酵母的最佳表达条件:A₃B₂C₁,在诱导时间为96 h、诱导温度为28℃、甲醇浓度为0.5%时,重组酵母的表达能达到最优,表达量为13.6 mg/L。采用管碟法测定杂合抗菌肽Me-HNP1对于革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌、肠炎沙门氏菌）的抑菌效果。结果表明,杂合抗菌肽Me-HNP1对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌均有抑菌效果,MIC值分别为:3μg/m L、4μg/m L、2μg/m L,与蜂毒肽（melittin）相比对于大肠杆菌的抑菌能力提升约2倍,对于金黄色葡萄球菌的抑菌活性提升3倍以上,与HNP1活性基本持平。动物细胞溶血活性试验表明,与1μg/m L即发生100%溶血作用的蜂毒肽相比,杂合抗菌肽Me-HNP1的红细胞溶血率下降了约400倍,杂合抗菌肽含量在100μg/m L时,红细胞溶血率约为47%,在含量为400μg/m L时,红细胞溶血率达到100%。杂合抗菌肽Me-HNP1稳定性（热稳定性,酸碱稳定性与遗传稳定性）研究结果表明,杂合抗菌肽Me-HNP1酸碱耐受性较好,能在p H 2-10的范围内依然具有生物活性,在p H超过7后,抑菌活性呈下降趋势;煮沸40 min后,杂合抗菌肽抑菌活性消失;传代培养10次后,表达蛋白对细菌仍有抑制作用,PCR扩增在149 bp处得到一条清晰条带,说明目的基因并未丢失。综上所述,本研究已成功构建真核表达载体p PICZαA-Me-HNP1,并在毕赤酵母表达系统中成功诱导表达。经过多重试验表明,杂合抗菌肽Me-HNP1具有良好的抑菌活性和较低的溶血毒性。