取代脲类除草剂自上世纪中期被推入市场以来,在世界范围内被广泛施用,成为除草剂大家庭中重要成员之一。然而,随着该类除草剂的不断施用,其残留造成对环境的危害问题也逐渐凸显,有证据表明,取代脲类除草剂及其代谢产物对微生物、植物、动物及人类都有毒害作用。因而,取代脲类除草剂的吸附、迁移和分解等环境行为备受关注。在自然环境条件下,微生物在该类除草剂的降解过程中发挥着主要作用,因此,取代脲除草剂的微生物降解及其分子机理成为研究的热点。根据苯环上取代基差异,取代脲类除草剂可分为N,N-二甲基取代脲类除草剂和N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂两类。目前,国际上已报道了几十株能降解取代脲类除草剂的微生物,有意思的是,能够矿化N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂的微生物主要来自Variovorax属细菌,而能够矿化N,N-二甲基取代脲类的菌株则大多是sphingomonads(Sphingomonas、Novosphingobium、Sphingopyxis 和 Sphingobium 属被统称为sphingomonads)。最近,本实验室阐明了 sphingomonads代谢N-甲氧基-N-甲基取代脲的分子机理。以菌株Sphingobium sp.YBL2为例,其代谢异丙隆的主要途径为:异丙隆在脱甲基酶PdmAB的作用下在N基团上脱掉一个甲基生成1-(4-异丙基苯基)-3-甲基脲(MDIPU),PdmAB可以继续在MDIPU的N基团上脱掉一个甲基生成1-对异丙基苯基脲(DDIPU),MDIPU和DDIPU在水解酶DdhA的作用下脲桥断裂,生成对异丙基苯胺(4IA),4IA在苯胺氧化酶ADO的作用下生成4-异丙基邻苯二酚(4-IPC),4-IPC经开环途径一系列酶的作用后进入TCA循环。但是,该研究并未对PdmAB和DdhA进行重组表达和纯化。针对该问题,本论文重点研究了 PdmAB和DdhA的重组表达、纯化和酶学特性,其次我们还以菌株YBL2为研究材料,初步研究了苯胺氧化酶ADO的催化机理。具体工作可分为以下三个方面。(1)Sphingobium sp.YBL2中脱甲基酶PdmAB的异源表达及其酶学功能的研究PdmAB必须依赖电子传递链蛋白才能发挥催化功能,但在基因组中并未该类蛋白与其相邻。通过研究分析加氧酶PdmAB的分类地位,从YBL2基因组中寻找到一个GR-type的还原酶PdmC和3个[3Fe-4S]-type的铁氧化还原蛋白PdmD1、PdmD2和PdmD3。对这些蛋白分别进行异源表达,通过亲和层析对融合蛋白进行纯化。体外实验表明PdmC和PdmD3组合能较好地为PdmAB提供电子。PdmAB酶活反应的最适酶促反应温度为30℃,最适pH为7.5,Hg2+、Co2+、Al3+、Cu2+和Zn2+等离子均强烈抑制酶的活性。(2)Sphingobium sp.YBL2中水解酶DdhA的异源表达条件的优化及其酶学性质研究通过共表达分子伴侣蛋白、更换表达载体和菌株和优化诱导条件等手段,有效地提高了 DdhA表达量。通过亲和层析对融合蛋白进行纯化。SDS-PAGE分析发现,DdhA大小约80kDa左右,这与预测的蛋白分子量大小一致。通过HPLC方法,鉴定了 DdhA催化MDIPU水解的产物为对异丙基苯胺(4IA)。有意思的是,DdhA还可以作用于氨基甲酸酯类农药西维因和呋喃丹,产物分别为α-萘酚和呋喃酚。DdhA分解MDIPU的最适酶促反应温度为35 ℃,最适pH为7.5,1 mM的Fe2+、Ca2+、Mn2+和Mg2+等对酶活性没有明显的影响,Hg2+、Cu2+和Zn2+等离子均强烈抑制DdhA的活性。Ni2+和Co2+能够抑制其约50%的活性。(3)苯胺基因簇ado的初步研究初步研究了苯胺氧化酶ADO中的谷氨酰胺合成酶AdoQ的底物谱,结果显示AdoQ影响ADO的底物谱。此外,我们还通过RT-PCR实验验证了adoXEGKLIJC是在同一操纵子上,并验证了 AdoXEGKLIJC负责4-IPC的开环。