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慢性髓性白血病(Chronic Myeloid Leukemia CML)是一种常见的造血干细胞的异常增殖疾病,也属于一种获得性恶性克隆性疾病,慢性髓性白血病在我国是一种常见的白血病类型,慢性髓性白血病自然病程分为三个:慢性期(Chronic Phase,CP)、加速期(Accelerated Phase, AP)、急变期(Blastic Phase,BP).加速、急变期被认为是疾病进展.慢性髓性白血病特征性的t(9;22)(q34;q11)异位形成BCR-ABL融合基因,这个融合基因所编码的P210蛋白具有比较强的酪氨酸激酶活性,使其下游的一系列的蛋白发生磷酸化,进而影响细胞的增殖、凋亡等一系列的生理过程,是慢性髓性白血病发病的分子生物学基础之一.酪氨酸激酶抑制剂在慢性髓性白血病治疗进程中是一个里程碑事件,其大大改善了慢性髓性白血病预后及生存质量.但是随着这种药物在临床的不断的应用,有一部分患者出现了耐药,进而导致疾病进展,这部分患者治疗效果欠佳,预后较差.为解决这一难题,全世界都在寻找新的治疗靶点,来克服这一难题.
原癌基因的激活以及抑癌基因的失活是肿瘤发生的两个主要的机制,遗传学及表观遗传学调控抑癌基因的失活.不同于遗传学概念,表观遗传学是指基因发生了可遗传的改变但DNA序列没有相应发生改变,这种变化在细胞增殖及发育过程中能够稳定的传递.
通过基因组测序,我们发现只有2%的基因是有编码蛋白的功能的,剩下的绝大部分都没有编码蛋白质功能,非编码RNA又根据其长度分为两类,一类是长度小于200核苷酸序列的,包括Piwi相关RNA(piRNAs)、微小RNA(miRNAs)、干扰RNA(siRNAs),另外一类是长度超过200核苷酸序列,成为长链非编码RNA.原来这些非编码RNA被称为转录噪声并不具备生物学功能,但是近些年的一些临床研究越来越表明,这些长链非编码RNA在基因转录及转录后调控起着比较重要的作用.
肿瘤细胞中最常见的表观遗传学调控方式主要包括DNA甲基化及组蛋白修饰,与肿瘤的发生及进展关系密切.基的启动子在某个部位发生甲基化,其后果是可以直接阻碍转录因子与启动子结合,在这个基础上进一步抑制基因转录,组蛋白的乙酰化修饰主要受两个酶的作用,一个是组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyhansferase, HATs),另一个是组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDACs).其主要作用是减低组蛋白乙酰化水平,从而使染色质的结构发生紧缩,这种情况导致的结果是,其阻碍DNA与转录因子结合,最终影响细胞的一系列的生物学功能,如增殖、凋亡、分化.
本课题旨在构建lncRNA在与慢性髓性白血病进展期与慢性期及正常人表达谱,并筛选一个差异最大的lncRNA,对其进行功能的初步研究,并进一步探究DNA甲基化及组蛋白乙酰化修饰对长链非编码RNA的调控作用,为探索lncRNA参与CML进展的分子机制提供新的思路及实验基础,并为CML进展期的治疗提供新的方向治疗思路,本研究论文分为三部分:
第一部分慢性髓性白血病进展期长链非编码RNA表达谱的建立
目的:通过高通量测序的方法,建立慢性髓性白血病进展期的长链非编码RNA表达谱.并对表达差异的lncRNA的进行初步验证.
方法:40例2017年1月-2018年7月在河北医科大学第二医院血液科住院的病人,按照其疾病分期分为,慢性期20例,加速期10例,急变期10例.10例骨髓造血干细胞移植供者作为正常对照,在这些标本中找到符合lncRNA测序要求的9例标本(三例健康对照,三例慢性期,三例加速急变期),应用高通量测序对9例标本的lncRNA表达谱进行差异性分析.得到CML进展期与慢性期和正常对照之间lncRNA的差异表达谱.综合NCBIRefSeq、UCSC、RNAdb、LncRNAs等数据库资源,对芯片结果进行生物信息学分析,计算Pearson相关系数建立lncRNA与靶基因的基因网络图,基于测序结果的质控,以及我们查阅文献的情况,我们应用实时荧光定量PCR方法对在测序选取的差异性的,lncRNA即MEG3在40例临床样本中进行验证.
结果:
1.高通量测序发现,进展期患者差异表达的lncRNA上调表达的487个,下调表达的226个.
2.挑选一个差异最大的lncRNA:MEG3,qRT-PCR方法在40例临床标本中进行验证,结果发现lncRNAMEG3在CML的加速急变期患者的相对表达量(0.573±0.062)显著高于CML加速期(0.217±0.029)和急变期(0.216±0.03),差异有统计学意义(P<0.05).
结论:
1.本研究首次采用高通量测序揭示CML进展期与慢性期患者异常的lnRNA表达谱,其中487个lnRNA表达上调,226个lnRNA表达下调,Pathway分析显示共富集到JAK/STAT通路、MAPK通路、NF-κB、bcl-2等通路.
2.对明显表达异常的lncRNA-MEG3基因采用qRT-PCR在CML患者进行验证,结果与测序结果一致,CML进展期MEG3基因表达量较慢性期显著减低.
第二部分MEG3在慢性髓性白血病急变细胞系K562及KCL22细胞生物学功能的探讨
目的:选用慢性髓性白血病急变细胞系K562、KCL2作为研究对象,构建并转染慢病毒载体过表达MEG3,观察对K562及KCL2细胞系增殖、凋亡等生物学行为的影响及凋亡蛋白的表达变化,同时观察沉默miR21后对K562及KCL22细胞系增殖、凋亡的影响及凋亡蛋白表达的变化,探讨西达苯胺及5-azacytidine对DNMT1、HDAC1、EZH2、MEG3、miR21的表达影响.
方法:应用甲基化测序的方法检测MEG3的启动子的表达情况.构建过表达MEG3的慢病毒及合成miR21的抑制物,分别转染K562及KCL22细胞系,应用MTT及FCM检测过表达MEG3慢病毒及抑制miR21后K562及KCL2细胞的增殖及凋亡变化,PCR及WesternBlot检测DNMT1、HDAC1、EZH2、MEG3、miR21mRNA及蛋白表达,RNApulldown及RNA免疫共沉淀鉴定与MEG3相互作用的蛋白,在KCL22细胞中,以小鼠IgG抗体作为对照抗体,CoIP-MS检测与JAK2相互作用的蛋白,双荧光素报告基因实验明确MEG3是否是miR21的靶基因.
结果:
1BSP法检测MEG3基因启动子甲基化情况
在KCL22细胞中,5-azacytidine药物处理前MEG3基因启动子甲基化CpG(96.5%)显著高于处理后(69.2%)(P<0.05).
在K562细胞中,5-azacytidine药物处理前MEG3基因启动子甲基化CpG为95.3%,处理后为87.3%,差异无统计学意义(P>0.05)
25-azacytidine及西达本胺处理细胞后DNMT1、HDAC1、MDM2、EZH2及miR21基因水平的表达变化
2.15-azacytidine处理后基因的变化
5-azacytidine干预后MEG3的mRNA相对表达量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05).
在KCL22细胞中,5-azacytidine干预后DNMT1、HDAC1、MDM2、EZH2及miR21的mRNA相对的表达量均下降(P均<0.05).
在K562细胞中,5-azacytidine处理后DNMT1、HDAC1、MDM2、EZH2mRNA相对表达量较处理前均显著降低(P均<0.05);miR21mRNA的相对的表达量是明显要低于对照组的(P<0.05),低浓度组相比于中浓度组无统计学差异(P>0.05),5-azacytidine处理后MEG3mRNA相对表达量明显高于处理前(P<0.05).
2.2西达苯胺处理细胞后各个基因的表达变化
在KCL22细胞中,西达苯胺可以恢复KCL22细胞MEG3mRNA的表达,差异有统计学意义(P<0.05)同时还能下调DNMT1、miR21、EZH2mRNA表达量,差异均有统计学意义(P<0.05);西达苯胺干预后HDAC1mRNA表达量明显下调,差异有统计学意义(P<0.05),低浓度组与中浓度组之间无统计学差异(P>0.05).
在K562细胞中,西达苯胺可以恢复MEG3mRNA;抑制HDAC1、EZH2、miR21mRNA表达,(P<0.05),DNMT1mRNA的相对表达量明显下调,相对于对照组有统计学差异(P<0.05),不同浓度组间无统计学差异(P>0.05).
3过表达MEG3可以抑制K562和KCL2细胞系的增殖,提高细胞凋亡率.抑制miR21表达后KCL22及K562细胞增殖明显受抑,细胞凋亡细胞比例显著上升(P<0.05).
4过表达MEG3后K562和KCL2的MMP-2、MMP-9、bcl-2的基因和蛋白表达显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达显著增高(P<0.05),而bcl-2及Bax的基因表达不受影响(P>0.05).
5荧光素酶报告基因实验结果显示,MEG3作为吸附海棉吸附miR21
6沉默miR21后K562和KCL2细胞MMP-2、MMP-9、bcl-2的基因及蛋白表达水平显著减低,Bax的基因及蛋白表达显著增强,差异均具有统计学差异(P<0.05).
7在KCL22细胞中,通过RNApulldown及质谱鉴定分析发现MEG3与DNMT1、HDAC1、JAK2、STAT3互作,RNA免疫共沉淀证实这几个基因确实与MEG3存在互作关系,通过免疫共沉淀及质谱分析发现JAK2与TYK2有互作关系.
结论:
1.体外功能试验结果显示,过表达MEG3及沉默miR21对K562及KCL22细胞株的恶性生物行为具有负调控作用,能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,在这一过程中,凋亡蛋白bcl-2出现了异常的表达,共同参与调节.
2.lncRNAMEG3在CML进展期细胞系的异常表达以及它们参与调控的信号通路提示lncRNA-MEG3在CML进展的进程中起到了非常重要的调控作用;表观遗传学的相关药物可以上调K562及KCL22细胞MEG3基因表达及其相关调控基因的表达,进一步明确了MEG3的生物学功能,为探索lncRNA参与CML病程进展的分子机制提供了新的思路和实验基础.
3.荧光素酶报告基因实验证实了miR21是MEG3基因的直接靶基因.
第三部分lncRNAMEG3的结合蛋白HDAC1在慢性髓性白血病急变的调控机制的研究
目的:探讨lncRNAMEG3结合蛋白HDAC1对慢性髓性白血病急变细胞株一些生物学功能的如增殖凋亡的影响,应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理K562及KCL22细胞后,检测HDAC1调控基因如SP1、SP3、MDM2、PTEN、SHIP基因及蛋白的表达.探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂对K562及KCL22的组蛋白修饰的影响.
方法:应用免疫共沉淀检测与HDAC1相互作用的蛋白,并用质谱鉴定,构建干扰HDAC1的慢病毒,转染K562及KCL22细胞,MTT及FCM检测沉默HDAC1后K562及KCL2细胞的增殖及凋亡情况,沉默HDAC1表达后,WB方法检测SP1、SP3、MDM2、PTEN、SHIP蛋白的表达,应用不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(西达本胺及LBH589)处理K562及KCL22,PCR及WB方法检测SP1、SP3、MDM2、PTEN、SHIP基因及蛋白的表达变化.
结果:
1.免疫共沉淀质谱分析显示:在KCL22细胞中,实验组的抗体共沉淀下来的蛋白原液一共鉴定2584个蛋白,在对照组抗体共沉淀下来的蛋白原液共鉴定到1193个蛋白.有184个蛋白只是在实验组可以单独被检测出,经过质谱鉴定及蛋白数据库分析显示SP1、SP3、MDM2、PTEN、SHIP与HDAC1直接结合,软件分析可知富集到的蛋白主要参与细胞存活与死亡、蛋白质的合成、细胞生长和增殖、细胞功能与维护等生物过程,富集到多条信号通路,与肿瘤、组织损伤、遗传性疾病有关,恶性血液病密切相关.
2.药物处理细胞后mRNA的表达变化
1)西达本胺处理细胞后mRNA的表达变化
在K562细胞中,药物处理后,SP1、SP3mRNA表达量明显下降,SHIPmRNA表达量明显升高,以高浓度组最为显著,差异有统计学意义(P<0.05),MDM2mRNA表达显著下降,高浓度组与中浓度及低浓度组相比有统计学差异(P<0.05),中浓度组与低浓度组相比无统计学差异(P>0.05).
在KCL22细胞中,药物处理后,MDM2mRNA表达量明显下降,PTENmRNA表达量明显升高,以高浓度组最为显著,差异有统计学意义(P<0.05),中间浓度组MDM2表达与低浓度组相比无统计学差异(P>0.05),SP1、SP3mRNA表达量下降,高浓度组与中浓度及低浓度组有统计学差异(P<0.05),高浓度组SP1表达水平与中浓度组相比无统计学差异(P<0.05).
2)LHB589处理细胞后mRNA的变化情况
在K562细胞中,药物处理后,SP3mRNA表达量明显下降,SHIP、PTEN表达量明显升高,以高浓度组最为显著,差异有统计学意义(P<0.05),SP1、MDM2、表达量下降,其中SP1在高浓度组表达显著低于中浓度和低浓度组(P<0.05),低浓度组与中浓度组相比无统计学差异(P>0.05),MDM2在高浓度组及中浓度组的表达显著低于低浓度组(P<0.05),在高浓度组与中浓度组之间表达无统计学差异(P>0.05).
在KCL22细胞中,药物处理后,SP3、MDM2表达量明显下降,SHIP基因表达量明显升高,以高浓度组最为显著,差异具有统计学意义(P<0.05),SP1表达量下降,高浓度组、中浓度组、低浓度组三组之间均有统计学差异(P<0.05).
3.药物处理细胞后各个蛋白的表达情况
在KCL22细胞中,应用西达本胺及LBH589后,MDM2、SP1、SP3蛋白表达量下降,差异均有统计学差异(P均<0.05),SHIP、PTEN表达量显著升高(P均<0.05).
在K562细胞中,应用西达本胺及LBH589后,SP1、SP3、MDM2蛋白表达量下降(P均<0.05),SHIP、PTEN表达量升高(P均<0.05).
4.沉默HDAC1对CML急变细胞株K562及KCL22增殖及凋亡的影响
构建沉默HDAC1的慢病毒,顺利转染K562及KCL22细胞,应用嘌呤霉素筛出稳转细胞株,HDAC1表达量显著下降,提示干扰成功,从转染后第3天开始,干扰组增殖明显受抑,细胞凋亡比例显著上升(P<0.05).
5.沉默HDAC1后对与HDAC1相互作用的蛋白表达变化
沉默HDAC1后,SP1、SP3、MDM2蛋白的表达量明显下降,SHIP、PTEN蛋白表达量明显升高(P<0.05).
结论:
1.西达苯胺及LBH589下调K562及KCL2细胞SP1、SP3、MDM2基因及蛋白表达,上调SHIP及PTEN的基因及蛋白表达.其机制可能与这两种药物对HDAC1去乙酰化有关,提示组蛋白修饰及RNA相关的异常调节是CML进展的机制之一.
2.沉默HDAC1后抑制K562及KCL2细胞增殖并促进其凋亡,HDAC1抑制剂有望在慢性髓性白血病进展期治疗中发挥作用.
原癌基因的激活以及抑癌基因的失活是肿瘤发生的两个主要的机制,遗传学及表观遗传学调控抑癌基因的失活.不同于遗传学概念,表观遗传学是指基因发生了可遗传的改变但DNA序列没有相应发生改变,这种变化在细胞增殖及发育过程中能够稳定的传递.
通过基因组测序,我们发现只有2%的基因是有编码蛋白的功能的,剩下的绝大部分都没有编码蛋白质功能,非编码RNA又根据其长度分为两类,一类是长度小于200核苷酸序列的,包括Piwi相关RNA(piRNAs)、微小RNA(miRNAs)、干扰RNA(siRNAs),另外一类是长度超过200核苷酸序列,成为长链非编码RNA.原来这些非编码RNA被称为转录噪声并不具备生物学功能,但是近些年的一些临床研究越来越表明,这些长链非编码RNA在基因转录及转录后调控起着比较重要的作用.
肿瘤细胞中最常见的表观遗传学调控方式主要包括DNA甲基化及组蛋白修饰,与肿瘤的发生及进展关系密切.基的启动子在某个部位发生甲基化,其后果是可以直接阻碍转录因子与启动子结合,在这个基础上进一步抑制基因转录,组蛋白的乙酰化修饰主要受两个酶的作用,一个是组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyhansferase, HATs),另一个是组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDACs).其主要作用是减低组蛋白乙酰化水平,从而使染色质的结构发生紧缩,这种情况导致的结果是,其阻碍DNA与转录因子结合,最终影响细胞的一系列的生物学功能,如增殖、凋亡、分化.
本课题旨在构建lncRNA在与慢性髓性白血病进展期与慢性期及正常人表达谱,并筛选一个差异最大的lncRNA,对其进行功能的初步研究,并进一步探究DNA甲基化及组蛋白乙酰化修饰对长链非编码RNA的调控作用,为探索lncRNA参与CML进展的分子机制提供新的思路及实验基础,并为CML进展期的治疗提供新的方向治疗思路,本研究论文分为三部分:
第一部分慢性髓性白血病进展期长链非编码RNA表达谱的建立
目的:通过高通量测序的方法,建立慢性髓性白血病进展期的长链非编码RNA表达谱.并对表达差异的lncRNA的进行初步验证.
方法:40例2017年1月-2018年7月在河北医科大学第二医院血液科住院的病人,按照其疾病分期分为,慢性期20例,加速期10例,急变期10例.10例骨髓造血干细胞移植供者作为正常对照,在这些标本中找到符合lncRNA测序要求的9例标本(三例健康对照,三例慢性期,三例加速急变期),应用高通量测序对9例标本的lncRNA表达谱进行差异性分析.得到CML进展期与慢性期和正常对照之间lncRNA的差异表达谱.综合NCBIRefSeq、UCSC、RNAdb、LncRNAs等数据库资源,对芯片结果进行生物信息学分析,计算Pearson相关系数建立lncRNA与靶基因的基因网络图,基于测序结果的质控,以及我们查阅文献的情况,我们应用实时荧光定量PCR方法对在测序选取的差异性的,lncRNA即MEG3在40例临床样本中进行验证.
结果:
1.高通量测序发现,进展期患者差异表达的lncRNA上调表达的487个,下调表达的226个.
2.挑选一个差异最大的lncRNA:MEG3,qRT-PCR方法在40例临床标本中进行验证,结果发现lncRNAMEG3在CML的加速急变期患者的相对表达量(0.573±0.062)显著高于CML加速期(0.217±0.029)和急变期(0.216±0.03),差异有统计学意义(P<0.05).
结论:
1.本研究首次采用高通量测序揭示CML进展期与慢性期患者异常的lnRNA表达谱,其中487个lnRNA表达上调,226个lnRNA表达下调,Pathway分析显示共富集到JAK/STAT通路、MAPK通路、NF-κB、bcl-2等通路.
2.对明显表达异常的lncRNA-MEG3基因采用qRT-PCR在CML患者进行验证,结果与测序结果一致,CML进展期MEG3基因表达量较慢性期显著减低.
第二部分MEG3在慢性髓性白血病急变细胞系K562及KCL22细胞生物学功能的探讨
目的:选用慢性髓性白血病急变细胞系K562、KCL2作为研究对象,构建并转染慢病毒载体过表达MEG3,观察对K562及KCL2细胞系增殖、凋亡等生物学行为的影响及凋亡蛋白的表达变化,同时观察沉默miR21后对K562及KCL22细胞系增殖、凋亡的影响及凋亡蛋白表达的变化,探讨西达苯胺及5-azacytidine对DNMT1、HDAC1、EZH2、MEG3、miR21的表达影响.
方法:应用甲基化测序的方法检测MEG3的启动子的表达情况.构建过表达MEG3的慢病毒及合成miR21的抑制物,分别转染K562及KCL22细胞系,应用MTT及FCM检测过表达MEG3慢病毒及抑制miR21后K562及KCL2细胞的增殖及凋亡变化,PCR及WesternBlot检测DNMT1、HDAC1、EZH2、MEG3、miR21mRNA及蛋白表达,RNApulldown及RNA免疫共沉淀鉴定与MEG3相互作用的蛋白,在KCL22细胞中,以小鼠IgG抗体作为对照抗体,CoIP-MS检测与JAK2相互作用的蛋白,双荧光素报告基因实验明确MEG3是否是miR21的靶基因.
结果:
1BSP法检测MEG3基因启动子甲基化情况
在KCL22细胞中,5-azacytidine药物处理前MEG3基因启动子甲基化CpG(96.5%)显著高于处理后(69.2%)(P<0.05).
在K562细胞中,5-azacytidine药物处理前MEG3基因启动子甲基化CpG为95.3%,处理后为87.3%,差异无统计学意义(P>0.05)
25-azacytidine及西达本胺处理细胞后DNMT1、HDAC1、MDM2、EZH2及miR21基因水平的表达变化
2.15-azacytidine处理后基因的变化
5-azacytidine干预后MEG3的mRNA相对表达量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05).
在KCL22细胞中,5-azacytidine干预后DNMT1、HDAC1、MDM2、EZH2及miR21的mRNA相对的表达量均下降(P均<0.05).
在K562细胞中,5-azacytidine处理后DNMT1、HDAC1、MDM2、EZH2mRNA相对表达量较处理前均显著降低(P均<0.05);miR21mRNA的相对的表达量是明显要低于对照组的(P<0.05),低浓度组相比于中浓度组无统计学差异(P>0.05),5-azacytidine处理后MEG3mRNA相对表达量明显高于处理前(P<0.05).
2.2西达苯胺处理细胞后各个基因的表达变化
在KCL22细胞中,西达苯胺可以恢复KCL22细胞MEG3mRNA的表达,差异有统计学意义(P<0.05)同时还能下调DNMT1、miR21、EZH2mRNA表达量,差异均有统计学意义(P<0.05);西达苯胺干预后HDAC1mRNA表达量明显下调,差异有统计学意义(P<0.05),低浓度组与中浓度组之间无统计学差异(P>0.05).
在K562细胞中,西达苯胺可以恢复MEG3mRNA;抑制HDAC1、EZH2、miR21mRNA表达,(P<0.05),DNMT1mRNA的相对表达量明显下调,相对于对照组有统计学差异(P<0.05),不同浓度组间无统计学差异(P>0.05).
3过表达MEG3可以抑制K562和KCL2细胞系的增殖,提高细胞凋亡率.抑制miR21表达后KCL22及K562细胞增殖明显受抑,细胞凋亡细胞比例显著上升(P<0.05).
4过表达MEG3后K562和KCL2的MMP-2、MMP-9、bcl-2的基因和蛋白表达显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达显著增高(P<0.05),而bcl-2及Bax的基因表达不受影响(P>0.05).
5荧光素酶报告基因实验结果显示,MEG3作为吸附海棉吸附miR21
6沉默miR21后K562和KCL2细胞MMP-2、MMP-9、bcl-2的基因及蛋白表达水平显著减低,Bax的基因及蛋白表达显著增强,差异均具有统计学差异(P<0.05).
7在KCL22细胞中,通过RNApulldown及质谱鉴定分析发现MEG3与DNMT1、HDAC1、JAK2、STAT3互作,RNA免疫共沉淀证实这几个基因确实与MEG3存在互作关系,通过免疫共沉淀及质谱分析发现JAK2与TYK2有互作关系.
结论:
1.体外功能试验结果显示,过表达MEG3及沉默miR21对K562及KCL22细胞株的恶性生物行为具有负调控作用,能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,在这一过程中,凋亡蛋白bcl-2出现了异常的表达,共同参与调节.
2.lncRNAMEG3在CML进展期细胞系的异常表达以及它们参与调控的信号通路提示lncRNA-MEG3在CML进展的进程中起到了非常重要的调控作用;表观遗传学的相关药物可以上调K562及KCL22细胞MEG3基因表达及其相关调控基因的表达,进一步明确了MEG3的生物学功能,为探索lncRNA参与CML病程进展的分子机制提供了新的思路和实验基础.
3.荧光素酶报告基因实验证实了miR21是MEG3基因的直接靶基因.
第三部分lncRNAMEG3的结合蛋白HDAC1在慢性髓性白血病急变的调控机制的研究
目的:探讨lncRNAMEG3结合蛋白HDAC1对慢性髓性白血病急变细胞株一些生物学功能的如增殖凋亡的影响,应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理K562及KCL22细胞后,检测HDAC1调控基因如SP1、SP3、MDM2、PTEN、SHIP基因及蛋白的表达.探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂对K562及KCL22的组蛋白修饰的影响.
方法:应用免疫共沉淀检测与HDAC1相互作用的蛋白,并用质谱鉴定,构建干扰HDAC1的慢病毒,转染K562及KCL22细胞,MTT及FCM检测沉默HDAC1后K562及KCL2细胞的增殖及凋亡情况,沉默HDAC1表达后,WB方法检测SP1、SP3、MDM2、PTEN、SHIP蛋白的表达,应用不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(西达本胺及LBH589)处理K562及KCL22,PCR及WB方法检测SP1、SP3、MDM2、PTEN、SHIP基因及蛋白的表达变化.
结果:
1.免疫共沉淀质谱分析显示:在KCL22细胞中,实验组的抗体共沉淀下来的蛋白原液一共鉴定2584个蛋白,在对照组抗体共沉淀下来的蛋白原液共鉴定到1193个蛋白.有184个蛋白只是在实验组可以单独被检测出,经过质谱鉴定及蛋白数据库分析显示SP1、SP3、MDM2、PTEN、SHIP与HDAC1直接结合,软件分析可知富集到的蛋白主要参与细胞存活与死亡、蛋白质的合成、细胞生长和增殖、细胞功能与维护等生物过程,富集到多条信号通路,与肿瘤、组织损伤、遗传性疾病有关,恶性血液病密切相关.
2.药物处理细胞后mRNA的表达变化
1)西达本胺处理细胞后mRNA的表达变化
在K562细胞中,药物处理后,SP1、SP3mRNA表达量明显下降,SHIPmRNA表达量明显升高,以高浓度组最为显著,差异有统计学意义(P<0.05),MDM2mRNA表达显著下降,高浓度组与中浓度及低浓度组相比有统计学差异(P<0.05),中浓度组与低浓度组相比无统计学差异(P>0.05).
在KCL22细胞中,药物处理后,MDM2mRNA表达量明显下降,PTENmRNA表达量明显升高,以高浓度组最为显著,差异有统计学意义(P<0.05),中间浓度组MDM2表达与低浓度组相比无统计学差异(P>0.05),SP1、SP3mRNA表达量下降,高浓度组与中浓度及低浓度组有统计学差异(P<0.05),高浓度组SP1表达水平与中浓度组相比无统计学差异(P<0.05).
2)LHB589处理细胞后mRNA的变化情况
在K562细胞中,药物处理后,SP3mRNA表达量明显下降,SHIP、PTEN表达量明显升高,以高浓度组最为显著,差异有统计学意义(P<0.05),SP1、MDM2、表达量下降,其中SP1在高浓度组表达显著低于中浓度和低浓度组(P<0.05),低浓度组与中浓度组相比无统计学差异(P>0.05),MDM2在高浓度组及中浓度组的表达显著低于低浓度组(P<0.05),在高浓度组与中浓度组之间表达无统计学差异(P>0.05).
在KCL22细胞中,药物处理后,SP3、MDM2表达量明显下降,SHIP基因表达量明显升高,以高浓度组最为显著,差异具有统计学意义(P<0.05),SP1表达量下降,高浓度组、中浓度组、低浓度组三组之间均有统计学差异(P<0.05).
3.药物处理细胞后各个蛋白的表达情况
在KCL22细胞中,应用西达本胺及LBH589后,MDM2、SP1、SP3蛋白表达量下降,差异均有统计学差异(P均<0.05),SHIP、PTEN表达量显著升高(P均<0.05).
在K562细胞中,应用西达本胺及LBH589后,SP1、SP3、MDM2蛋白表达量下降(P均<0.05),SHIP、PTEN表达量升高(P均<0.05).
4.沉默HDAC1对CML急变细胞株K562及KCL22增殖及凋亡的影响
构建沉默HDAC1的慢病毒,顺利转染K562及KCL22细胞,应用嘌呤霉素筛出稳转细胞株,HDAC1表达量显著下降,提示干扰成功,从转染后第3天开始,干扰组增殖明显受抑,细胞凋亡比例显著上升(P<0.05).
5.沉默HDAC1后对与HDAC1相互作用的蛋白表达变化
沉默HDAC1后,SP1、SP3、MDM2蛋白的表达量明显下降,SHIP、PTEN蛋白表达量明显升高(P<0.05).
结论:
1.西达苯胺及LBH589下调K562及KCL2细胞SP1、SP3、MDM2基因及蛋白表达,上调SHIP及PTEN的基因及蛋白表达.其机制可能与这两种药物对HDAC1去乙酰化有关,提示组蛋白修饰及RNA相关的异常调节是CML进展的机制之一.
2.沉默HDAC1后抑制K562及KCL2细胞增殖并促进其凋亡,HDAC1抑制剂有望在慢性髓性白血病进展期治疗中发挥作用.