目的:肺孢子菌（Pneumocystis）是一种呈世界性分布且体外培养较困难的机会致病性真菌,其宿主广泛,可存在于人及多种动物肺内,但具有明显的宿主特异性。感染人的肺孢子菌称为耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii,P.jirovecii）,可引起严重的肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jirovecii Pneumonia,PJP or Pneumocystis pneumonia,PCP）,PJP/PCP主要发生于免疫功能低下者,尤其是人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）感染者,接受放、化疗的恶性肿瘤患者,器官移植受者等先天或后天免疫机能受损者。近年来,PJP/PCP的发生率在非HIV感染者中如炎症性肠疾病（Inflammatory Bowel Disease,IBD）,侵袭性肺曲霉菌病（Invasive pulmonary aspergillosis,IPA）,自身免疫性疾病（Autoimmune disease,AID）等患者中呈逐年上升趋势。此外,在免疫功能正常的宿主机体中,特别是患有慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）等呼吸系统疾病患者肺内,P.jirovecii的定植现象（colonization）非常普遍,故有学者认为P.jirovecii的定植可能与该类疾病的发生发展相关,但目前,两者的因果关系尚有待于进一步确定。深入研究P.jirovecii定植与呼吸系统疾病的关系,对探究COPD等呼吸系统疾病的发病机制及其防控策略与治疗措施等具有特别重要的意义。PJP/PCP一旦发生,病情进展迅速,病死率极高。P.jirovecii的定植状态虽不引起临床症状,但具有传染性,是更危险的传染源,是导致院内感染的重要高危因素。因此,及时诊断PJP/PCP患者和发现P.jirovecii携带者以及分析流行病学研究,对于追溯其传染源,预防PJP/PCP的传播和控制院内感染等都具有重要意义。本研究通过建立检测P.jirovecii基因的新方法,对COPD等呼吸系统疾病患者呼吸道分泌物中P.jirovecii基因进行检测,调查其阳性率及其分子流行病学特征,并对阳性基因进行测序、分型;通过建立PCP动物模型并收集P.jirovecii基因阳性患者的临床资料,研究Pneumocystis的定植或感染所导致的肺组织病理特征、炎性细胞反应及细胞因子表达情况,分析Pneumocystis致病特点及其与COPD等呼吸系统疾病的相关性。研究结果可为临床P.jirovecii定植的检测及PJP/PCP的诊断提供先进的方法;为P.jirovecii的分子流行病学提供可靠的资料;为P.jirovecii的致病作用研究开拓新思路,为COPD等呼吸系统疾病的发病机制及防治策略研究提供新途径。研究方法:1.Nested PCR体系的建立及其特异性敏感性检测建立检测P.jirovecii线粒体大亚基mt LSU rRNA基因的巢式PCR体系,并与其他呼吸道常见真菌、细菌进行特异性检测;构建mt LSU-pMD18T重组质粒并倍比稀释,进行敏感性检测。2.实时荧光LAMP方法的建立及其特异性敏感性检测首先建立检测P.jirovecii 18s rRNA基因的环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）方法并进行优化;之后进一步建立实时荧光LAMP方法并进行进一步优化,应用其他常见呼吸道真菌、细菌作对照,进行特异性检测;构建18S rRNA-pMD18T重组质粒,倍比稀释后,进行敏感性检测。3.P.jirovecii与COPD相关性的临床研究收集COPD等呼吸系统疾病患者呼吸道分泌物,用Giemsa和GMS染色法检测P.jirovecii包囊,分别采用PCR、Nested PCR、实时荧光LAMP分别检测P.jirovecii基因,根据基因检出率分析P.jirovecii在呼吸系统疾病患者中的分子流行病学特征;同时收集患者临床资料,研究P.jirovecii与COPD等呼吸系统疾病的相关性。4.P.jirovecii ITS基因型及分子流行病学分析将前述方法所得源于我国东北某地区和华北某地区HIV阴性呼吸系统疾病患者呼吸道分泌物中P.jirovecii基因阳性标本,以P.jirovecii ITS（ITS1-5.8S rRNA-ITS2）为靶基因,对临床患者呼吸道分泌物中检测出的P.jirovecii ITS基因进行克隆、测序,与GenBank上已登记的基因型进行比对,比较不同地域呼吸系统疾病患者基因型多样性,分析鉴定其基因型,期望为我国P.jirovecii的基因型分布特征提供可靠信息,P.jirovecii的分子流行病学研究提供重要依据,为推断PJP/PCP的感染源和传播机制奠定一定的理论基础,进而为PJP/PCP的预防和治疗提供重要的参考价值。5.Pneumocystis致病性及其与COPD相关性实验研究通过建立PCP动物模型,制备PCP大鼠组织病理学切片观察其肺组织是否存在与COPD相似性的病理学特征,流式细胞术检测PCP动物模型BALF和脾组织中炎性细胞的变化,以及RT-qPCR,免疫组化,Western Blot,明胶酶谱法,ELISA等方法研究观察PCP大鼠模型肺组织中与COPD发生发展相关因子MMPs（MMP-2,MMP-8,MMP-9,MMP-12）以及热休克蛋白HSP-27的表达情况,研究肺孢子菌的致病机制及其与COPD的发生发展中作用的分子机制。结果:1.Nested PCR检测体系的建立建立了检测P.jirovecii mt LSU基因的Nested PCR的体系,分别与其他常见呼吸道真菌或细菌进行特异性检测,结果显示仅肺孢子菌检测结果为阳性,其余常见呼吸道真菌和细菌检测结果均为阴性,表明本研究建立的检测肺孢子菌mt LSU基因的Nested PCR体系特异性强;构建mt LSU-pMD18T重组质粒,比较普通PCR与Nested PCR进行敏感性检测,结果显示普通PCR与Nested PCR的最低检出限分别为10⁴ copies/μl和10² copies/μl,即Nested PCR比普通PCR的检测敏感性高100倍,表明本研究建立的Nest PCR体系具有较高的敏感性。2.实时荧光LAMP方法的建立成功建立了检测P.jirovecii 18S rRNA基因的LAMP及实时荧光LAMP方法,分别与其他常见呼吸道真菌或细菌进行特异性检测,结果显示仅肺孢子菌检测结果为阳性,其余常见呼吸道真菌和细菌检测结果均为阴性,表明LAMP及实时荧光LAMP检测肺孢子菌特异性强;构建18S rRNA-pMD18T重组质粒,比较普通PCR方法与LAMP及实时荧光LAMP方法的敏感性,结果显示普通PCR、LAMP及实时荧光LAMP的最低检出限分别为10⁴ copies/μl、50copies/μl和10 copies/μl,表明本研究建立的LAMP及实时荧光LAMP与普通PCR相比具有较高的敏感性。3.P.jirovecii与COPD等呼吸系统疾病相关性的临床研究结果2016年10月至2018年1月共收集HIV阴性呼吸系统疾病患者的呼吸道分泌物标本403例,分别应用PCR、Nested PCR、实时荧光LAMP进行P.jirovecii基因检测,结果发现患者的P.jirovecii基因阳性率分别为40.45%（163/403）,58.56%（236/403）,69.73%（281/403）;仅有1例Giemsa与GMS染色为阳性0.25%（1/403）;PCR与实时荧光LAMP检测P.jirovecii基因阳性符合率为100%;Nested PCR与实时荧光LAMP检测P.jirovecii基因阳性符合率为87.59%。收集患者临床病历资料,统计并分析临床各参数与P.jirovecii基因检测阳性率的相关性,结果显示HIV阴性呼吸系统疾病患者中P.jirovecii定植或感染与1,3-β-D-葡聚糖、CRP、CD₄⁺T淋巴细胞计数、HRCT、肺功能FEV1/FVC等临床指标密切相关,尤其是HRCT、FEV1/FVC,提示P.jirovecii与COPD等呼吸系统疾病发生发展存在一定的相关性。4.P.jirovecii ITS基因型及分子流行病学分析结果结果3中403例HIV阴性呼吸系统疾病P.jirovecii基因阳性者呼吸道分泌物经Nested PCR扩增的ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因,25例患者的序列符合P.jirovecii ITS基因型分析;分别经TA克隆,筛选,测序,共获得139条克隆序列。根据ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因结构特征,每条序列进行同源性比较,根据其分型命名标准,进行序列分析和分型,共获得19种ITS基因序列,包括5种已报道ITS基因型和14种为ITS新序列组合;其中Bi型是出现频率最高的基因型。东北辽宁某地区和华北山西某地区最常见的ITS基因型分别是是Bi型和Eb型,Eb型华北地区患者和东北地区患者中共同出现。因此,我国不同地域P.jirovecii ITS基因型存在差异性和相似性。5.Pneumocystis致病性及其与COPD相关性实验研究结果（1）PCP大鼠模型的肺组织病变:肺泡腔融合甚至萎陷;肺泡壁断裂,肺间隔增厚,肺组织增生;肺泡腔内充满粉色泡沫样渗出物;肺泡间质呈不同程度充血、水肿及炎性细胞浸润;严重者呈肺泡腔全部萎陷,肺组织实变;与曾报道的香烟烟雾诱导COPD大鼠模型肺组织病变十分相似。（2）流式细胞术检测结果:与对照组相比,流式细胞术检测PCP动物模型BALF和脾组织中巨噬细胞、CD₈⁺T淋巴细胞、粒细胞水平均升高（P值均<0.01）,CD₄⁺T淋巴细胞水平降低（P<0.01）,差异具有统计学意义。（3）PCP大鼠模型中与COPD相关因子的表达水平检测结果:RT-qPCR,免疫组化,Western Blot,ELISA等方法研究观察PCP大鼠模型肺组织中MMPs以及HSP-27 mRNA水平及其蛋白水平的表达较对照组均有所增高;明胶酶谱法结果显示MMP-2与MMP-9在PCP大鼠肺脏组织活性较空白对照组增强。结论:1.本研究建立了检测P.jirovecii mt LSU基因的Nested PCR体系,应用该技术检测呼吸系统疾病患者呼吸道分泌物中P.jirovecii mt LSU rRNA基因,结果表明该技术具有特异性强、比普通PCR敏感性高等优点,且发现患者的P.jirovecii定植率较高（58.56%）。2.本研究自行设计建立了检测P.jirovecii 18S rRNA基因的实时荧光LAMP新方法,并证明该方法具有特异性强、敏感性高的特点,适用于临床患者呼吸道分泌物中P.jirovecii基因的检测,且发现呼吸系统疾病患者中P.jirovecii的定植率较高（69.73%）。3.P.jirovecii定植或感染与呼吸系统疾病患者中1,3-β-D-葡聚糖、CRP水平的增高、CD₄⁺T淋巴细胞计数的降低、HRCT出现GGO、肺功能FEV1/FVC的降低等临床指标的变化密切相关,尤其是HRCT出现GGO、肺功能FEV1/FVC的降低对于P.jirovecii定植或感染的临床辅助诊断具有十分重要的价值。4.我国不同地域P.jirovecii ITS基因型存在差异性和相似性;我国P.jirovecii ITS基因型存在遗传多样性。5.Pneumocystis定植或感染与COPD相关因子的表达呈正相关,表明二者可能存在某种关联。