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精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性体内唯一具有自我更新和分化功能的生殖细胞,又被称为雄性生殖干细胞(male germline stem cells,mGSCs)。精原干细胞虽然只占雄性总体生殖细胞的0.03%,但它却是雄性动物源源不断得产生精子,维持雄性生殖能力的基础。奶山羊是我国一种重要的经济性家畜,为人类提供丰富的奶制品和肉制品;同时它还是重要的生物反应器。但生殖力低下极大的限制了奶山羊的发展和应用。探索奶山羊精原干细胞自我更新、增殖和分化,在优秀种质资源的保存,和通过基因编辑技术获得优良奶山羊品系等方面具有重大意义。LIN28A是哺乳动物体内唯一一个同时具有冷休克结构和CCHC锌指结构的蛋白。它既可以结合DNA,在转录水平调控基因的表达;又可以结合RNA,在转录后水平调控基因的表达。LIN28A特异性表达在精原干细胞的细胞质中,可以作为雄性生殖干细胞的生物学标记。但其在奶山羊雄性生殖细胞中的表达和功能尚不清楚。在本研究中,我们探索了LIN28A在雄性奶山羊中的表达模式及其对奶山羊精原干细胞干性维持和自我更新的影响,并发现LIN28A通过表观修饰调控NANOG的表达。实验结果如下:1.LIN28A是一个广谱表达的基因,且在不同物种间具有高度的进化保守性。在本研究中,我们成功克隆了奶山羊LIN28A完整的CDS并对其序列、结构和表达谱进行了初步探索。奶山羊和牛、原鸡、人、鼠、绵羊、野猪的LIN28A氨基酸序列具有相似的亲水性和疏水性分布,序列相似性高达95.01%。结构域预测分析发现奶山羊LIN28A蛋白也具有和小鼠LIN28A蛋白相似的冷休克结构和CCHC锌指结构,这表明奶山羊LIN28A蛋白也具有一定的功能保守性。实时荧光定量PCR实验表明LIN28A在奶山羊的肝脏组织中表达量最高,其次是胰腺组织,在睾丸组织中的表达量较低。LIN28A在3月龄的睾丸组织中表达量最高,随着睾丸的发育其表达量降低。免疫荧光染色结果表明LIN28A主要特异性定位于奶山羊精原干细胞的细胞质中,在细胞核中也有少量表达,表明LIN28A可以作为奶山羊雄性生殖干细胞的标记。2.成功构建了奶山羊LIN28A的慢病毒过表达载体pLIN28A-CDH-CMV-EF1,并筛选出了稳定过表达LIN28A的mGSCs-I-SB细胞系GmGSCs-I-SB-Lin28a和对照组细胞系GmGSCs-I-SB-GFP。超表达LIN28A增强mGSCs-I-SB细胞系的细胞活力和增殖能力,同时不引起细胞凋亡的发生。GmGSCs-I-SB-Lin28a细胞系具有更短的群体倍增时间,增殖相关基因PCNA的表达量显著上调;BrdU的阳性率也明显高于对照组。GmGSCs-I-SB-Lin28a细胞系的干性相关基因OCT4,SOX2和自我更新相关基因PLZF,ETV5,GFRα1上调表达。以上结果表明,LIN28A在奶山羊精原干细胞的增殖、自我更新和干性维持等方面发挥重要的作用。3.GmGSCs-I-SB-Lin28a细胞系在白消安诱导的生精缺陷小鼠睾丸内环境中具有更强的增殖能力。移植GmGSCs-I-SB-Lin28a和GmGSCs-I-SB-GFP细胞系小鼠的睾丸的大小和重量没有明显差异;GmGSCs-I-SB-Lin28a移植组睾丸中具有更多VASA阳性的生殖细胞,平均每个生精小管中PCNA阳性细胞更多。但两组移植组附睾中均没有移植细胞源的精子细胞,说明GmGSCs-I-SB-Lin28a和GmGSCs-I-SB-GFP细胞系均不能完成分化过程。此外,我们发现LIN28A能通过激活mTOR/S6信号通路促进GmGSCs-I-SB的增殖。4.双荧光素酶实验和重亚硫酸盐处理测序实验表明,奶山羊15号染色体上的NANOG基因只有一个外显子,其启动子区不具有活力,转录起始位点附近的GC富集区高度甲基化;5号染色体上的NANOG基因有四个外显子,启动子GC富集区甲基化水平较低,具有很强的启动子活力,是一个功能性基因。5.5号染色体上NANOG基因的-1167→+201 5’UTR区具有最强的启动子活力,该区域存在两个可能的LIN28A结合位点(-783和-210)。启动子截短实验发现和-1167?→+?201启动子相比,LIN28A对-573→?+?201区域的启动子活力的增强能力没有明显差异,这表明LIN28A可能通过结合-210促进NANOG的表达。6.过表达LIN28A,不改变GmGSCs-I-SB整体组蛋白H3K4ME1/2/3的修饰水平和基因组整体甲基化修饰水平,但改变特定位点的DNA甲基化修饰水平。GmGSCsI-SB-Lin28a细胞系的5号染色体NANOG基因启动子的甲基化修饰水平更低。LIN28A和TET1在奶山羊精原干细胞中共定位,Co-IP实验证实两者之间存在互作关系。LIN28A结合NANOG启动子,并募集TET1对启动子区进行去甲基化修饰,促进NANOG的转录,而且该过程不依赖于Let-7g。综上所述,我们探究了LIN28A在雄性奶山羊体内的表达模式和LIN28A对其雄性生殖干细胞增殖与自我更新过程的影响,揭示了LIN28A可能通过募集TET1到NANOG的启动子,对其进行去甲基化修饰从而促进其表达的机制。我们的研究为探索奶山羊雄性生殖干细胞的增殖、自我更新、多能性的机理提供了新的科学依据;为优秀奶山羊种质资源的保存、繁育和通过基因编辑技术获得优良奶山羊品系等提供了新的方案。