乳汁营养丰富,不仅食用方便,而且容易消化,特别是母乳,更是人类和其他哺乳动物婴儿最理想的天然食品,可以促进婴儿的免疫系统发育和功能完善,增强机体全身性的疾病抵抗能力。MicroRNAs (miRNAs)是一类长约22 nucleotide (nt)、单链、高度保守的非编码小RNA分子,在真核生物中广泛存在,主要通过与靶基因mRNA3’非编码区互补结合来抑制表达或使其降解,进而在转录后调控基因的表达。越来越多的研究表明,miRNA也参与到乳汁的生成功能,并影响其免疫调控相关的功能。然而,目前仍没有关于miRNA在大熊猫乳汁中的调控作用研究,其中的机理也不明确。于是,本研究以大熊猫不同时间点的乳汁作为研究材料(0d、3d、7d、15d、30d),通过高通量测序的技术手段,检测乳汁中的microRNAome,并比较分析其阶段特征,为从分子水平解释乳汁的生成和调控的机制,主要结果如下：(1)本实验首次成功地构建了大熊猫泌乳初期5个不同时间点(出生后Od、3d、7d、15d、30d)乳汁中miRNA的动态表达谱,填补了目前miRBase数据库大熊猫miRNA信息记录的空白。(2)为了评估实验结果的可靠性和操作稳定性,对平行实验的结果做了相关性分析,同时用荧光定量的方式验证了高通量测序的数据。结果显示：生物学重复之间相关系数高(r>0.95,P<0.05),表明本研究所用生物学个体具有非常强的重复性； 高通量测序与Q-PCR验证结果之间有很好的相关性(r>0.8,P<0.05),反应了本研究所获得的高通量测序数据高可信度。综合表明,本次实验操作稳定性强,miRNA高通量测序的结果准确可靠,保证了后续的分析结果的可信、可靠。(3)高通量测序结果表明,大熊猫乳汁中表达了大量的miRNAs,绝大部分测序数据能够定位到大熊猫基因组中,并且能够比对到多种哺乳动物在miRBase数据库中的前体序列。过滤后的Clean数据,绝大部分的小RNA长度在21-24 nt,并且22 nt长度的测序数据占据大部分(47.89%),其次为21和23nt长度的小RNA序列,分别占到了总测序小RNA数据的22.14%和20.32%,这些小RNA序列长度的特征符合典型的Dicer酶加工后的产物,满足miRNA的基本结构特性。(4)通过生物信息分析的方法,高通量测序结果在5个时期的乳汁共7个miRNA测序文库中(0d、3d-1、3d-2、3d-3、7d、15d、30d),共鉴定了320个熊猫乳汁中表达的miRNA,其来源于226条前体miRNA序列。(5)通过序列比对分析,结果发现大熊猫表达的miRNA序列,在哺乳动物间高度保守。本次实验鉴定的miRNA序列绝大部分能在9个物种中同时比对上(18.75%),其次有51条miRNA序列(15.94%)能同时比对到10个哺乳动物的miRNA前体数据库(miRBase 20.0),并且有71条序列在大于10个哺乳动物间高度保守(22.19%)。95%以上的1niRNA序列,至少在5种哺乳动物中都保守性的存在。(6)与其他动物及组织的miRNA表达谱类似,依然存在多个前体序列(pre-miRNA)编码相同成熟miRNA序列的现象,最终大熊猫乳汁中所鉴定的320个成熟体miRNA,对应于282条特异性的miRNA序列,即至少有38条miRNA序列产生于两个及以上不同的前体序列或基因组位置。(7)在]miRNA表达量的丰度上,大熊猫乳汁分泌的各个阶段,都展现出极为类似的偏向于少数种类的miRNA非常高丰度的表达(表达量前25%的miRNA,能表达该阶段90%以上的表达量,并且表达量最高的10个miRNA能占到该库一半的表达量),而绝大多数的miRNA呈低丰度的表达(75%的miRNA,仅表达该阶段不到7%的表达量。(8)通过比较分析不同泌乳阶段的miRNA表达谱,结果发现绝大多数种类的miRNA在各个泌乳阶段都有表达(154,54.61%),并且其中的39种类型的miRNA序列持续高丰度表达(从出生到30天),靶基因和通路分析结果暗示：这些持续高丰度表达的miRNA对维持大熊猫在调控大熊猫泌乳系统的完善和泌乳都发挥着重要的调控作用,也在调控大脑、神经、脉管系统、内脏器官、肢体等的发育和完善中具有重要作用；与持续高丰度表达的miRNA相比,虽然只有少数种类的miRNA仅在某一泌乳阶段特异性地表达(57,20.210%)并且表达的丰度很低(reads<1000),但这些阶段特异性的miRNA适应了不同泌乳阶段的需要,特别是在初乳阶段促进免疫相关的通路和调控元件。(9)对各泌乳阶段同时表达的miRNA表达量做短时间序列分析(STEM),以进一步探究不同泌乳阶段的miRNA表达规律,结果表明：其中有2种类型的表达模式呈显著富集的类型,并且在初乳中高表达的miRNA富集于细胞基础代谢相关的生物过程和通路,在常乳中富集的miRNA富集于脑、神经、心血脉管、内脏及肢体的发育等通路。(10)通过不同阶段乳汁中miRNA表达谱信息聚类分析,结果发现乳汁中miRNA的表达谱展现出泌乳阶段特异性,即在初乳与常乳间存在着统计学差异。结果表明：初生后0天和3天的乳汁聚为一类,而7天、15天和30天的乳汁聚为另一类。(11)高通量测序的(将测序得到的数据,与竹子的基因组序列和其在miRBase中收录的数据进行比对)和荧光定量验证的结果,都发现在大熊猫乳汁中,真实存在着竹子的miRNA序列,并且在熊猫体内具有很好的稳定性,暗示了大熊猫主食竹子中的miRNA可能是通过消化道而直接进入大熊猫的体内发挥其调控功能,从而潜在影响着大熊猫泌乳系统的发育和乳汁的分泌。综上所述,本研究不仅首次构建了大熊猫的miRNA表达谱,丰富了大熊猫基础数据库的参考信息,同时比较分析了大熊猫不同泌乳阶段miRNA表达谱的特征及差异,鉴定出了各泌乳阶段持续高表达和特异表达的miRNA,并预测分析了它们在乳汁中的生物调控作用,也探究了植物miRNA对大熊猫乳汁分泌的影响,研究结果有助于解释miRNA在大熊猫泌乳和早期免疫完善中的调控角色。