研究背景血管新生(angiogenesis)是指在机体受到外界作用后从既存的毛细血管中生长出新的微血管的过程,是一个从原始血管网向复杂的血管网生长和重构的过程。血管新生过程由内皮细胞的多种生物学行为组成,包括内皮细胞被激活,内皮细胞发生增殖分化和迁移及小管形成等。因此,血管内皮细胞(vascular endothelial cells)在血管新生过程中扮演着重要的角色。在成年个体中,新血管的形成主要来源于血管新生过程。血管新生在肿瘤,糖尿病等多种疾病的发生和发展中发挥重要作用。探究血管新生的发生机制,通过阻断异常的血管新生对于治疗血管新生性疾病具有重要的意义。Tie2是特异性表达于内皮细胞的酪氨酸蛋白激酶受体,可由其配体血管生成素(Angiopoietin,Ang)激活。在Tie2基因缺失的动物模型中证实,Tie2对胚胎血管发育具有重要的意义。研究证实,Tie2信号通路通过促进内皮细胞的增殖和血管重构进而促进血管新生。神经突起导向因子4(Netrin4,NTN4)是一种分泌蛋白,在结构上与层粘连蛋白有关。NTN4参与血管新生的调节。体内和体外实验均表明,可溶性NTN4蛋白可通过诱导血管或淋巴管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成来促进血管生成。Notch信号通路在物种间高度保守,是决定细胞分化、增殖和命运的关键。内皮细胞表达Notch1、Notch3、Notch4受体和DLL1、DLL4、Jagged1和Jagged2配体。Notch1信号功能的丧失和获得都会在血管发育过程中导致严重的血管缺陷。在血管形成过程中,Notch1信号通路通过协调叶尖内皮细胞和叶柄内皮细胞行为确保血管网的形成。Notch1调控多种血管新生作用因子的表达,如血管内皮细胞-钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)等。本研究假设在内皮细胞中Notch1信号通路调控血管新生作用因子Tie2和NTN4的表达,并进一步探究Notch1调控Tie2表达的分子机制,我们的发现可能对血管新生性疾病的治疗提供新的靶点和理论支持。研究目的1.探究激活的Notch1通路对血管新生作用因子NTN4基因表达的影响;2.探究激活的Notch1通路对血管新生作用因子Tie2基因表达的调节及机制。研究方法1.Notch1信号通路对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的Tie2和NTN4表达及NTN4分泌的影响1.1 Notch1受体胞内段(NICD1)对HUVECs表达Tie2和NTN4的影响用克隆了 NICD1基因编码序列的慢病毒转染HUVECs,收获NICD1感染的HUVECs,该细胞表达高水平的NICD1蛋白。收集细胞并通过Western blotting实验、qPCR实验、免疫荧光实验检测NICD1对Tie2表达的影响,通过Western blotting实验、qPCR实验检测NICD1对NTN4表达的影响。由于NTN4蛋白是一种分泌蛋白,收集细胞培养基,进行Western blotting实验和考马斯亮蓝染色分析,检测NICD1对HUVECs分泌NTN4蛋白的影响。1.2 DLL4配体介导的Notch1的激活对HUVECs表达Tie2的影响为了模拟生理条件下Notch1信号通路的激活,本实验使用终浓度为5μg/ml的DLL4配体溶液预先包被细胞培养板,然后将HUVECs接种在DLL4包被的细胞培养板中培养24小时。收集细胞进行Western blotting实验、qPCR实验、免疫荧光实验分析DLL4配体对内皮细胞Tie2表达的影响。1.3 Notch通路的抑制剂对HUVECs表达Tie2和NTN4的影响为进一步验证NICD1对Tie2的影响,本实验使用终浓度为2(VM的Dibenzazepine溶液(DBZ,是一种γ-分泌酶的抑制剂,可抑制Notch受体发生水解形成活性片段NICD1)刺激细胞24小时。收集细胞进行Western blotting实验和qPCR实验以检测Notch通路的抑制剂DBZ对Tie2和NTN4表达水平的影响。同时收集细胞培养基进行Western blotting实验和考马斯亮蓝染色分析,检测DBZ对HUVECs分泌NTN4蛋白的影响。2.激活的Notch1受体在体外培养的HUVECs中对GATA3表达的影响及机制2.1 NICD片段在体外培养的内皮细胞中对GATA3的影响收集NICD1转染的HUVECs分别进行Western blotting实验和qPCR实验,检测NICD1蛋白对内皮细胞GATA3表达水平的影响。2.2 DLL4配体介导的Notch1的激活对HUVECs的GATA3的影响收集经DLL4受体处理24小时的HUVECs,通过Western blotting实验和qPCR实验分析Notch1的配体DLL4对内皮细胞GATA3表达的影响。2.3 Notch通路的抑制剂对HUVECs的GATA3的影响收集经DBZ刺激24小时的HUVECs,通过进行Western blotting实验和qPCR实验检测Notch通路的抑制剂DBZ对GATA3的表达的影响。2.4激活的Notch1受体对GATA3转录水平的影响采用超声法破碎转染NICD1的HUVECs,获得适当长度的染色质片段后,加入NICD1蛋白抗体特异性捕获并沉淀DNA目的片段,经过分离纯化后,利用GATA3启动子引物进行PCR扩增,检测NICD1与GATA3启动子的结合能力。3.GATA3对内皮细胞Tie2表达的影响3.1 GATA3小干扰RNA(si-GATA3)对内皮细胞Tie2表达的影响为了验证GATA3对Tie2表达的影响,用40nM si-GATA3转染HUVECs,通过Western blotting实验和qPCR实验分析GATA3小干扰RNA对Tie2表达的影响。3.2 GATA3表达质粒(pGATA3)对内皮细胞Tie2表达的影响在六孔板的每个孔中加入2.5μg pGATA3和Lipofectamine3000转染试剂转染HUVECs,通过Western blotting实验和qPCR实验分析GATA3表达质粒对Tie2表达的影响。4.GATA3在Notch1调控内皮细胞Tie2表达水平中的作用和机制4.1 GATA3在Notch1调控Tie2表达水平中的作用为了进一步验证GATA3在Notch1调控Tie2表达中的作用,本实验利用si-GATA3将转染了 NICD1的HUVECs中GATA3基因沉默,然后通过Western blotting实验和qPCR实验检测Tie2的变化。4.2 GATA3介导Notch1调控Tie2表达的作用机制通过超声破碎转染NICD1的HUVECs,获得适当长度的染色质片段,加入GATA3蛋白抗体特异性捕获DNA目的片段,经过分离纯化后,使用Tie2启动子引物进行PCR扩增,检测NICD1对GATA3结合Tie2启动子的能力的作用。采用pRL-CMV载体构建包含NICD1编码序列的质粒。采用pGL3-basic多克隆位点载体构建包含Tie2启动子片段质粒和GATA3突变质粒,其中Tie2启动子选择-405到+318片段,Tie2启动子的+98bp GATA3结合位点的碱基序列由GATAAGTGTTTTGATGAATTGCGAGATGGATA 突变为 TCGCAGTGTTTTTCG TAATTGCGAGATGTCGC。将 0.75μg质粒用 Lipofectamine3000 试剂转染HUVECs后检测荧光强度,分析GATA3在Notch1调控Tie2启动子的影响。研究结果1.在体外培养的HUVECs中Notch1信号通路对血管新生作用因子Tie2和NTN4的影响研究表明:与对照组相比,在转染NICD1的HUVECs中,Tie2和NTN4的mRNA和蛋白表达水平显著升高,同时在细胞培养基中检测到更高水平的NTN4蛋白。与对照组比较,DLL4配体处理组的HUVECs表达更高水平的Tie2。反之,HUVECs经过DBZ处理后,Tie2和NTN4在细胞中的表达水平明显降低,NTN4蛋白在细胞培养基中的含量减少。2.在体外培养的HUVECs中激活的Notch1受体对GATA3表达的影响及机制研究表明:与对照组相比,在转染NICD1的HUVECs中,GATA3的mRNA和蛋白表达水平显著升高。与对照组比较,DLL4配体处理组的HUVECs表达更高水平的GATA3。反之,HUVECs经过DBZ处理后,GATA3的表达水平明显降低。染色质免疫共沉淀实验结果表明,NICD1通过特异性结合到GATA3启动子的-9488 CSL结合位点,激活GATA3启动子活性,启动GATA3的转录。3.GATA3对HUVECs中Tie2表达的影响研究表明:与对照组比较,HUVECs经过si-GATA3处理后,Tie2的mRNA和蛋白水平均有显著降低。反之,HUVECs经过pGATA3处理后,Tie2的mRNA和蛋白水平均升高。4.GATA3在Notch1调控内皮细胞Tie2表达中的作用及机制研究表明:与对照组(si-control)相比,转染NICD1的HUVECs经过si-GATA3处理后,原本由NICD1诱导的高表达的Tie2被降低。经过si-GATA3处理后,转染NICD1的HUVECs中Tie2的水平与未转染NICD1组的水平无统计学差异。染色质免疫共沉淀实验结果证明,NICD1通过特异性增加GATA3与Tie2启动子的结合,来增强Tie2启动子的活性,导致Tie2的表达增加。双荧光素酶报告基因检测实验结果证实,NICD1显著增强Tie2启动子的活性。GATA3结合位点突变后,Tie2启动子活性显著降低。GATA3结合位点突变后,NICD1对Tie2启动子活性的影响无统计学意义。研究结论激活的Notch1受体在内皮细胞中促进血管新生作用因子Tie2和NTN4的表达,同时促进内皮细胞分泌NTN4蛋白。Notch1诱导Tie2表达的增加是通过促进GATA3的转录表达介导的。高水平表达的GATA3转录因子促进Tie2的转录表达。