Epstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)是病毒癌蛋白，在鼻咽癌肿瘤发生过程中起着重要作用。LMP1常常在低分化鼻咽癌(NPC)中表达，表明这种病毒癌蛋白在NPC的发病机理中承担了关键效应分子的作用。近年来许多报道认为【LMP1多态性与某些肿瘤相关，可能参与了侵袭性程度更高的恶性表型的改变。例如在NPC中C端10个氨基酸缺失的LMP1比没有缺失的具有更高的致瘤潜能；来源于NPC表达的LMP1比NPC不表达的LMP1碱基突变频率高、免疫原性小。虽然以前的研究已表明在中国南方某些地区的NPC中存在LMP1特异性变异的EBV株，然而湖南地区NPC是否存在LMP1特异性变异的EBV株还未见报道，因为湖南也是NPC的高危地区，所以调查LMP1在湖南NPC中的流行特征，并建立合适的技术方法研究其功能差异是非常必要的。 【湖南鼻咽癌标本中LMP1的遗传变异特征】 为寻找NPC来源的LMP1(NLMP1)遗传变异的EBV株，从中国南方湖南省21例NPC标本中扩增LMP1基因跨全长ORF的基因组DNA(gDNA)，测序，并用Clustal V方法将我们获得的序列与以往报道的序列比较。 研究结果表明，EBV-Ⅰ型在湖南NPC中流行。湖南NLMP1与香港台湾序列同源性较高，为88.7-99.7％；大部分(18/21)含有Ch1型一存在C端10个氨基酸(aa)缺失，并伴有aa335(G-D)的改变，这10个氨基酸的缺失可能导致了一个CD4+T细胞表位的完全丢失。没有缺失的3例在这个表位上都有aa344(G-D)的改变。在CD4+T细胞的另2个表位，21个序列均有aa144(F-I，21/21)，212(G-S，19/21)或(G-N，2/21)的一致性改变和7个氨基酸位点新的散发性改变：aa131(W-C)，213(H-Q)，215(S-T)，218(N-D)，220(N-S)，221(E-D)，222(G-A)。其中131(W-C)的变异涉及了CD4+T和HLA-A2限制的CD8+T主要表位肽序列改变。其次，21例在HLA-A2限制的CD8+T主要表位肽序列上都存在aa 126(L-F)和129(M-I)改变，在Lin和Edwards等前人研究的基础上，我们新发现了5/21个序列在HLA-A2限制主要表位肽序列在aall5(G-A)呈现另一个变异。20/21例在NF-кB的活化区域有5个氨基酸位点的改变。其中aa 215(S-T)、355(G-A)是首次报道的。总之，湖南NLMP1存在高频率缺失、多个位点一致性或散发性突变，这些变异可能导致病毒对宿主细胞免疫识别的潜在逃避以及EBV潜伏感染的保护和肿瘤发生机率的增加。 【建立EBV感染性克隆技术，诱导产生可视化重组EBV】 为了在病毒的整个基因组中研究基因的功能，分析基因与基因之间的相互作用，把含有整个EBV基因组原型的Maxi-EBV质粒(p2089)首先转染至EBV阴性的HEK293细胞，经潮霉素筛选建立了HEK293/BAC稳定细胞系。再构建pcDNA3.1(+)/BZLF1和pcDNA3.1(+)/BALF4真核表达质粒，共转染至HEK293/BAC细胞内，诱导其裂解性复制产生可视化的重组EBV颗粒。重组EBV颗粒感染Raji细胞，在倒置荧光显微镜下和采用流式细胞仪记数GFP阳性细胞，根据这些“绿色Raji单位”确定病毒的滴度。这种以BAC为基础的EBV感染性克隆技术在国内首次建立，将允许对EB病毒基因组中任何基因的任何遗传修饰，为在整个基因组中对EB病毒基因功能的研究奠定了基础，也为对EBV与其相关的肿瘤如鼻咽癌发生机理的研究建立了新的技术平台。 【在Maxi-EBV中成功置换湖南鼻咽癌来源的LMP1基因(NLMP1)并诱导产生突变体重组EBV】 为了在Epstein-Barr病毒(EBV)基因组中引入突变以研究基因功能，为了在整个EBV基因组中研究NLMP1对细胞转化及细胞生长增殖等细胞生物学行为的影响，建立了一种简单有效的基因操作方法。首先，在载体pcDNA3.1(+)上操作，将两端含有FRT位点的卡那霉素筛选标记基因(kan)与湖南鼻咽癌(NPC4)来源的、包含LMP1全长ORF的gDNA(NLMP1)“无缝”连接(无外源序列插入)。Kan-NLMP1线性DNA片段经转化、由入噬菌体中red αβγ系统介导发生同源重组(ET克隆)，Kan-NLMP1替代了Maxi-EBV(p2089)中相应的LMP1基因区域，然后经过FLP对FRT-kan-FRT特异性的识别，切除了引入的kan基因，留下一个69bp的“疤痕”。通过抗性筛选和对菌液进行PCR扩增鉴定突变体，再通过测序证明在Maxi-EBV(p2089)中成功置换NLMP1序列的突变体命名为pNL-BAC。这种经改进并程序化的方法，也适应于引入其它突变或在其它BAC-疱疹病毒基因组中引入突变。 其次，我们采用EBV感染性克隆技术，把纯化的突变体pNL-BAC质粒转染至HEK293细胞。用潮霉素筛选建立了HEK293/pNL-BAC稳定细胞系。这些稳定细胞系经瞬时共转染pcDNA3.1(+)/BZLF1和pcDNA3.1(+)/BALF4两个质粒，诱导病毒复制，产生突变体重组EBV，并使其通过GFP的表达成为可视化。突变体重组病毒的产生有利于在整个EB病毒基因组中研究NLMP1基因的功能；有利于研究LMP1与其它相关基因的相互关系。 【NLMP1促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，活化NF-кB和AP-1信号通路】 通过MTT和细胞集落试验表明LMP1促进上皮细胞增殖，NLMP1比LMP1原型(WLMP1，B95-8)作用更明显(p<0.05)。流式细胞分析结果表明，与稳定转染HEK293/BAC细胞系比较，HEK293/pNL-BAC细胞系G1期细胞百分率明显减少和S期细胞百分率明显增加，细胞凋亡减少(p<0.05)。提示NLMP1促使细胞从静止状态进入分裂周期者增多，DNA合成增加，细胞增殖能力增强，并抑制凋亡形成。Western blot检测结果表明，在HEK293细胞中，NLMP1与WLMP1比较，细胞总蛋白中NF-кB(p65)、I кB-α、JNK2的表达增强，而c-Fos，c-Jun的表达减弱。提示NLMP1通过活化NF-кB和AP一1信号通路及其cross-talk，导致其它相关基因的表达变化，可能参与了许多生物学过程，促进细胞增殖，抑制凋亡形成，促使细胞向恶性表型转化。NLMP1在NPC的肿瘤发生和病毒持续感染中发挥重要的作用。 综上所述，本研究通过对湖南NLMP1序列特征的调查，发现NLMP1序列(与原型B95-8比较)存在高频率的缺失、多位点一致性或散发性突变。特别是在T细胞抗原表位的序列改变和NF-кB活化区域序列改变。再通过ET克隆技术成功地将鼻咽癌(NPC4)来源的NLMP1置换了Maxi-EBV中相应的LMP1基因区域。首次把病毒感染性克隆技术成功应用于鼻咽癌相关的EBV基因的功能研究，在EBV整个基因组中研究NLMP1基因变异对细胞生物学行为及对NF-кB和AP-1信号通路的影响。结果表明NLMP1可能通过基因序列差异和生物学特性差异及信号通路的活化，在NPC的肿瘤发生发展和病毒持续感染中发挥重要的作用。本研究建立了一组湖南NPC组织中LMP1编码区全序列的数据库资料；建立了从基因转染、EBV产生、系统评价、引入突变到EBV生物学功能实验研究的一整套体系，建立了EBV-上皮细胞模型。这是一个研究EBV与NPC关系的新的可靠的技术平台，为EBV的感染和NPC的发生发展提供了理论和实验依据。