米糠营养价值高,蛋白质的含量约为14%左右。米糠能预防心血管病、肿瘤等疾病,米糠中的功能性因子,对降血压以及降血脂也有适当的效果。由于米糠资源利用率低,造成严重的资源浪费,尤其是米糠中蛋白质的浪费。米糠中蛋白质根据溶解性分为四种蛋白：清蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和球蛋白。米糠蛋白因其均衡的氨基酸组成、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸比例高、生物利用率高和抗营养因子低等优点成为获得生物活性肽很好的蛋白质资源,米糠蛋白低分子的肽段具有更高的降压、抗氧化等功效。本研究以米糠蛋白为原料,采用限制性酶解技术,制备高活性ACE抑制肽,基于经典的米氏方程理论,应用数学推导结合试验研究的方法,利用Origin 8.0软件,拟合出水解速率动力学模型及水解度-水解时间的动力学模型。采用中试多功能组合超滤设备进行二次超滤脱盐分级,通过单柱色谱柱分离操作实验确定模拟移动床色谱分离技术参数并进行条件优化,获得工业化生产高纯度、高收率的ACE抑制肽的分离技术。进一步进行凝胶层析、高效液相色谱分离,得到纯化的组分利用Edman N-端测序法测定氨基酸序列；并对模拟移动床分离的ACE抑制肽进行体外、体内活性检测。本研究以米糠分离蛋白为主要原料,采用酶法制备、分离纯化米糠蛋白ACE抑制肽,主要研究内容及结果如下：1.以米糠分离蛋白为原料,选7种蛋白酶进行限制性水解米糠蛋白,选取用的蛋白酶有碱性蛋白酶、碱性蛋白酶Alcalase2.4 L、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K,通过测定水解物的ACE抑制率的大小,确定水解得到的米糠ACE抑制肽的理想蛋白酶种类。通过控制适宜水解温度,考察各种酶的不同pH条件下的水解物ACE抑制率,结果是碱性蛋白酶Alcalase2.4 L的抑制率显著高于其他酶,因此筛选出碱性蛋白酶Alcalase2.4 L为试验用酶。以碱性蛋白酶Alcalase2.4L为基础,确定酶解温度、加酶量、pH、底物浓度和酶解时间对产物ACE抑制率和水解度的影响,结果表明酶解温度为50℃、加酶量为3000 U/g、pH为8.0、底物浓度为3.0%、酶解时间为120 min时水解产物的抑制活性最高。以此确定的单因素条件为基础,经二次正交旋转组合试验设计对因素间相互作用的酶参数进行优化,确定底物浓度和温度、底物浓度和加酶量、加酶量和温度交互作用显著,确定限制性酶解米糠蛋白ACE抑制肽的优化条件为：酶解温度62℃,底物浓度3.6%,加酶量3567 U/g,酶解时间106 min, pH 8.5,米糠ACE抑制肽的ACE抑制率最大可达73.30%。2.以米糠分离蛋白-碱性蛋白酶Alcalase2.4 L建立酶解反应体系,基于米氏方程推导酶解动力学模型,确定水解度与水解时间的关系方程。根据水解反应条件,确定动力学模型参数,利用软件对水解度-水解时间关系进行非线性拟合,得到碱性蛋白酶酶解米糠蛋白的动力学模型,水解速率的动力学模型：R=(94.754E0/S0-0.0597) exp[-0.157(DH)]和水解度的动力学模型DH=6.37ln[1+(14.88E0/S0-0.009)t],其中动力学常数a=94.754E0/S0-0.0597,b=0.157,k2=94.754 min-,酶失活常数为16.144 min-1。通过分析水解反应动力学模型,在实际制备水解产物的生产中根据现有条件调控反应条件,更快的达到生产需求。3.以优化工艺获得的酶解米糠蛋白抑制肽混合物为原料,先进行无机陶瓷膜的初步过滤,再选用1000 Da和3000Da有机膜对混合酶解物进行分级。通过单因素试验考察超滤的温度、流量、时间和分离液浓度对膜通量及回收率、脱盐率的影响,再进行正交试验,最后确定最佳超滤工艺参数,并对超滤前后水解物的ACE抑制率进行比较,分析超滤后ACE抑制肽的活性变化。结果是超滤温度为30℃,分离流量为7 L/min时,时间米糠蛋白ACE抑制肽的率达到最大。分子量在<3000 Da的和分子量<1000 Da的ACE抑制率比较,肽段在1000 Da以内的ACE抑制率达到最高78.16%。4.为了使降血压肽用于工业化生产,采用D-152、007×1、HPD-400、HY-209、 XAD-7HP及XAD-761六种大孔树脂进行吸附率与解吸率的比较试验,筛选出吸附率与解吸率都明显高于其他树脂的XAD-761进行色谱分离。先确定单柱分离色谱分离条件,再对米糠蛋白ACE抑制肽进行模拟移动床色谱分离试验,色谱柱数量为20根,划分四个区。模拟移动床色谱分离操作技术参数为：以切换时间6min时,待分离ACE抑制肽进样浓度为15mg/mL,进样流速为7 mL/min、水洗1流速为22 mL/mi n.再生醇解吸流速为18mL/min.水洗2流速为28 mL/min时分离得到的米糠蛋白ACE抑制肽纯度为90.9%、收率为88.5%、ACE抑制率为84.4%。最后经HPLC检测确定米糠蛋白ACE抑制肽的分子量范围为250～510 D。5.经模拟移动床纯化处理的ACE抑制肽再采用SephadexG-15葡聚糖凝胶再进一步纯化,测定各个吸收峰分离活性物质的的生物活性,确定活性较强的收集峰,从而确定出分离时间,达到分离纯化的目的。凝胶层析分离条件为：以HAc-NaAc缓冲液为洗脱液、洗脱流速08mL/min.上样浓度100 mg/mL时分离效果好。获得的活性强的SP1组分的ACE抑制率可达89.45%；利用高效液相色谱法检测SP1的分子量范围为250-520之间,与质谱法确定的分子量分布基本一致。6.用分子排阻色谱分离SP1组分,得到6个组分,其中P3组分活性最高。利用高效液相色谱继续对P3组分,选择多肽在220 nm和280 nm两个波长有较高吸收峰进行分离效果比较,得到2个组分,收集各峰组分测定ACE抑制率,CP1组分活性最强,其浓缩液经冷冻干燥后,在0.1 mg/mL的水溶液中,测得其ACE抑制率达到94.84%,CP2组分ACE抑制率达到92.15%。以Edman降解法对CPl、CP2进行氨基酸序列鉴定,得到三肽Ala-Asn-Tyr及二肽Tyr-Val,所获得的Ala-Asn-Tyr三肽氨基酸序列此前未见有报道。7.经模拟移动床色谱分离技术获得的高活性米糠蛋白ACE抑制肽,测定其在不同的温度、pH、盐浓度、干燥方式及体外模拟的胃肠消化环境中ACE抑制率的变化,确定米糠蛋白ACE抑制肽的稳定性。温度对ACE抑制率的有影响,温度在4℃、25℃、37℃及在50～70℃时,抑制率稳定；当温度在90℃时ACE抑制率只有70.2%。说明米糠蛋白ACE抑制肽具有良好的耐高温性能。在强酸强碱的环境中米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率下降明显(p<0.05)。pH 3时,ACE抑制率最低,pH 8时达到最高,而pH 10时ACE抑制率又明显下降,只有70.6%。当NaCl溶液浓度为0～0.6 mol/L时,米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率稳定,NaCl溶液浓度超过0.8 mol/L以上时,ACE抑制率迅速下降,当NaCl溶液浓度达到1.2 mol/L时,ACE抑制率只有58.0%。热风干燥对米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率影响最大,冷冻干燥和喷雾干燥对米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率影响都不明显(P>0.05),冷冻干燥和喷雾干燥处理能保持米糠蛋白ACE抑制肽的稳定性。米糠蛋白ACE抑制肽在体外模拟胃肠环境中加胃蛋白酶后,ACE抑制率有所下降,先后加入胃蛋白酶和胰蛋白酶后,ACE抑制率的变化稍有下降,表明米糠蛋白ACE抑制肽水解液中的ACE抑制肽可以耐受胃肠道中的胃蛋白酶以及胰蛋白酶共同酶解作用。8.模拟移动床色谱分离的高纯度ACE抑制肽对原发性高血压(SHR)大鼠采用灌胃和静脉注射的方法,并与卡托普利组、普通大鼠(SD)进行对照确定米糠ACE抑制肽对SHR大鼠的降压效果。分别以低剂量组30mg/kg.bw、中剂量组60mg/kg、高剂量组90mg/kg-bw剂量灌胃给药；静脉给药剂量低剂量组15mg/kg.bw、中剂量组30mg/kg、高剂量组45 mg/kg·bw。一次性给药每2h测量大鼠血压变化情况,连续测量8h；长期给药(每天灌胃一次,持续5周),每周测量血压及体重一次。SHR大鼠给予米糠ACE抑制肽后,血压均显著下降(p<0.05),并均在灌胃后2h达到最低值,血压下降最大幅度为(31士6.8)mmHg；而正常大鼠灌胃米糠ACE抑制肽后血压无显著变化,灌胃卡托普利则会明显降低其血压；长期灌胃米糠ACE抑制肽可使SHR大鼠血压下降明显(p<0.05),且降压效果稳定,且体重明显增加。静脉注射给药剂量达到45 mg/kg·bw时,降压效果明显(p<0.05)。静脉注射剂量是灌胃给药的一半,降压效果好于灌胃给药。