家蚕细小病毒样病毒(Bombyx mori parvo-likevirus,BmPLV)是一种二分病毒。该病毒在家蚕中肠柱状细胞核内进行复制和包装,感染的细胞核呈现过分膨胀、细胞核孚尔根浓染等细胞病理学特征。病毒粒子直径20～24nm,无囊膜呈球型,衣壳呈二十面体对称结构。其基因组为单链线性双分子DNA(VDI、VD2),大小分别是6.6kb、6.1kb,分别独立包装在各自的衣壳中。该病毒基因组编码四个非结构蛋白NS1、NS2、NS3和pol(DNApolymerase),一个主要结构蛋白VP和一个次要结构蛋白P133。VD1、VD2末端具有的反向重复序列可形成与BmPLV复制有关的“锅柄形”结构以及含自身编码DNA聚合酶序列,推测该病毒基因组的复制方式与腺病毒相类似,以末端结合蛋白为起始复合物开始复制的。家蚕细小病毒样病毒粒子的特征研究仍然停留在比较原始的状态,缺乏更精细的外观研究。所以本实验从病毒的结构特征着手进行相关的研究,进而对病毒粒子结构蛋白组分及衣壳蛋白排布情况作了解析及推测。此外,由于DNA聚合酶是病毒基因组复制表达所必须的早期蛋白而VP蛋白在病毒粒子衣壳装配中所必须的且是衣壳主要组成部分,所以通过对DNA聚合酶和VP蛋白研究可以说明病毒粒子在家蚕中肠增殖过程中的表达动态及定位情况。　　 1、病毒粒子的电镜观察　　 将感病家蚕蚕粪进行匀浆、粗滤、硫酸铵沉淀等粗提,以便去除病毒液中的色素、脂质和杂蛋白等杂质。再经蔗糖和氯化铯两步密度梯度离心等精提,获取高纯度病毒粒子。经透析后的病毒粒子进行2%磷钨酸负染后,用透射电镜进行观察。在电镜下放大400,000倍可观察到病毒粒子呈现均一的球形结构,直径约为22nm,表面有许多小子粒凸起。其外观结构跟犬细小病毒相类似,在表面有囊突结构,凹凸花纹也与犬细小病毒粒子的相似,它的表面最突出的特点是按五重轴方向观看有凸起感,在定点处有尖刺状结构,据此推测衣壳蛋白可能是5-3-2对称的,按T=1的对称二十面体结构排列。提纯的病毒粒子在氯化铯高盐低温环境放置30天后的病毒也均匀排布,但是结构不够完整,出现空壳结构或者部分片状结构。　　 2、结构蛋白组分　　 利用SDS-PAGE电泳分离技术对提纯的病毒粒子进行蛋白组分分析,比较病毒结构蛋白的差异。实验结果显示,冷冻处理病毒粒子蛋白分析有2蛋白条带,大小分别是55kDa、53kDa;而经过高盐处理的病毒粒子蛋白分析却有4个条带,大小为55kDa、53kDa、29kDa、26kDa。高盐降解处理的病毒粒子蛋白组分要比冷冻储存的病毒粒子结构蛋白组分多,29kDa、26kDa条带在完整病毒液中均未检测到。对高盐降解的蛋白条带进行质谱鉴定,结果显示是病毒结构蛋白。未检测到的蛋白的现象与犬细小病毒的结构蛋白消失现象有极大渊源。　　 3、vp和pol在家蚕中肠增殖过程中的表达动态及定位　　 本实验主要采用组织冷冻切片和免疫荧光反应技术,检测该病毒进入中肠后主要基因表达动态。首先,选择对病毒敏感品种华八三五和具有抗性的秋丰。桑叶饲养幼虫至四龄,在四龄起蚕12h进行涂叶添毒,分别在0h-144h十个时间点剖取中肠组织。其次,家蚕中肠经多聚甲醛固定后在20%蔗糖中保存。去处理过的中肠组织用OCT冷冻包埋并进行切片。最后,用VP、pol抗体和绿色荧光二抗FITC显色,同时用蓝色荧光DAPI作为核定位参考内参,用荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜观察。结果显示:　　 1)、pol基因表达动态及定位:华八三五添毒36h,中肠柱状细胞中可观察到绿色荧光信号,荧光信号都集中在核的位置处,而秋丰未检测到相应信号。　　 2)、VP基因表达动态及定位:华八三五添毒60h后在中肠柱状细胞中检测到绿色荧光信号,随时间推移,该信号从胞质移向核内,而在抗性品系中没有检测到相应荧光信号。　　 这表明在感性品系中添毒36h后pol开始表达,说明病毒在36h后开始复制,在添毒60h后VP在柱状细胞质中合成后逐渐移向核内,揭示了病毒衣壳蛋白合成的动态变化途径,而在抗性品系中病毒不表达;在抗性品系中病毒没有进行增殖。