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研究背景与目的该研究首先分析弓形虫不同分离株GRA7基因的异同;构建pGEX-4T-1/GRA7重组质粒大肠杆菌表达体系,实现目的蛋白的体外表达,并对目的蛋白的抗原性进行分析;用纯化的重组融合蛋白作为包被抗原,做ELISA,检测阴性、阳性血清,以期对其血清学诊断价值作出客观的评价,为新型弓形虫病诊断试剂盒的研制奠定基础.研究方法1.弓形虫不同分离株GRA7基因的保守性鉴定从弓形虫感染的小鼠腹水中提取不同分离株(RH株、ZS<,2>株和GT株)的基因组DNA,然后以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物电泳鉴定.利用三种限制性内切酶(Esp3I、CfrI和MboI)对目的基因进行酶切,并分析酶切产物.再将目的基因重组入载体pGEX-4T-1,送基因公司测序,序列对比分析.2.pGEX-4T-1/GRA7重组质粒的构建及GST融合蛋白的表达将质粒DNA和GRA7基因分别进行双酶切(BamHI、EcoRI),纯化、鉴定并连接酶切产物,转化感受态细菌,构建pGEX-4T-1/GRA7重组质粒.酶切、PCR鉴定,并送基因公司测序.优化蛋白表达条件,IPTG体外诱导表达,对表达的融合蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析.3.融合蛋白的纯化和应用利用GSTrap FF柱纯化融合蛋白,用纯化的融合蛋白作为包被抗原,做ELISA,检测阴性、阳性血清.研究结论1.弓形虫不同分离株(RH株、ZS<,2>株和GT株)GRA7基因具有高度保守性.2.构建了pGEX-4T-1/GRA7重组质粒,成功地在体外表达了重组融合蛋白,Western-blot证实重组融合蛋白具有抗原性.3.重组融合蛋白作为包被抗原具有一定的敏感性和特异性,提示其具有潜在的诊断抗原的价值.