杆状病毒是一类双链、环状、超螺旋的DNA病毒,拥有80 kb到180 kb的基因组,编码大约100-180种蛋白。杆状病毒被人类广泛研究,以苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）最为突出,具有安全杀虫剂的称号,但因其杀虫时间慢等局限性而不被大范围使用。因此,加强杆状病毒活性以及全面了解其基因组中重要基因的功能尤为关键,特别是结构基因,ac132是其中之一。AcMNPV中的ac132位于基因组中的第132个开放阅读框,ac132基因全长660bp,编码关键的结构蛋白。有研究表明ac132的敲除对病毒DNA的复制和晚期基因没有明显的影响,但对病毒的形态发生有影响,ac132敲除以后,病毒发生基质（VS区）中出现包含单个核衣壳的卷毛状结构,基本不出现正常的棒状核衣壳,病毒发生基质出现的时间延迟。但是Ac132蛋白对子代病毒增殖的影响尚不明确,因此我们针对Ac132蛋白在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能展开研究。本研究主要分为三部分内容:第一部分:重组杆状病毒AcMNPV^ac132ko-EGFP、AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP的构建与Ac132-EGFP的表达分析首先,用λ-Red同源重组和Bac-to-Bac系统构建敲除ac132基因的病毒AcMNPV^ac132ko-EGFP,侵染Sf9细胞后观察到极少量的绿色荧光,表明敲除ac132基因大幅降低了AcMNPV子代病毒的增殖。为了确定这种现象确实是由ac132基因的敲除所引起的,我们又在P10启动子下构建了回补ac132基因的重组病毒AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP,观察到一、二、三代病毒侵染Sf9（Spodoptera frugiperda）细胞产生了大量的绿色荧光蛋白,表明了ac132基因是产生子代病毒不可缺失的。为进一步分析,我们构建了过表达Ac132的重组病毒AcMNPV-Ac132-EGFP。测定AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP的滴度,用5 MOI的AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP分别侵染Sf9细胞,Western blot结果表明,在AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP处理组中,Ac132-EGFP从24 h p.i.开始表达,并在36 h p.i.达到了表达的峰值;过表达AcMNPV-Ac132-EGFP处理组中,Ac132-EGFP从12 h p.i.开始表达,较AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP处理组提前了表达,在36 h p.i.同样达到表达高峰,并在随后的侵染时间段呈现较高的表达丰度。荧光显微镜观察结果与Western blot分析结果一致。第二部分:Ac132在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能首先,通过噬斑实验检测AcMNPV^ac132ko-EGFP、AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP子代病毒的增殖。结果表明,回补型AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP与野生型AcMNPV-EGFP子代病毒增殖的能力相当,而AcMNPV-Ac132-EGFP明显增加了子代病毒的产量,在36 h p.i.时,分别是AcMNPV-EGFP、AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP的5.55倍、2.28倍。那么过表达Ac132通过什么途径促进AcMNPV促进子代病毒增殖呢?之前的研究表明Ac132是结构蛋白并且随着侵染时间的推移定位于细胞核中,随后我们用Western blot定量检测了Ac132在细胞核的积累,用5 MOI的AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP侵染Sf9细胞,提取核蛋白,结果表明两个重组病毒处理组中Ac132在细胞核中都高度积累,说明Ac132在细胞核中发挥功能。那么它是如何进入细胞核呢?利用在线预测网站cNLS Mapper预测到在Ac132蛋白序列的第25-28位氨基酸残基处存在典型的核定位信号序列PPKK（脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸）。为明确PPKK序列对Ac132进入细胞核是否发挥作用,将PPKK全部突变为丙氨酸,构建了突变型病毒AcMNPV^ac132ko-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP,同时构建了过表达突变核定位信号的重组病毒AcMNPV-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP。接下来通过噬斑实验测定这两种突变型病毒子代病毒的增殖,相比AcMNPV-EGFP,突变型AcMNPV^ac132ko-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP抑制了子代病毒的产生;相较于AcMNPV-EGFP,过表达突变型AcMNPV-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP在48h p.i.子代病毒的产量约是野生型病毒的4倍,但仍比AcMNPV-Ac132-EGFP低,各种重组病毒转染或侵染宿主Sf9细胞的荧光观察结果与它们各自产生子代病毒的能力相对应。以上结果说明Ac132可通过PPKK核定位信号进入细胞核发挥功能并促进病毒增殖。另一方面,有研究表明Ac132的103-134位氨基酸残基与结合Actin的NEBU结构域同源,肌动蛋白在AcMNPV侵染宿主产生子代病毒的整个过程中都发挥着重要的作用,那么Ac132的过表达、突变会如何影响宿主细胞纤维状肌动蛋白F-actin进出细胞核?我们用5 MOI的AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP、AcMNPV-Ac132-EGFP、AcMNPV^ac132ko-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP和AcMNPV-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP侵染Sf9细胞,荧光显微镜观察用鬼笔环肽定位的纤维状肌动蛋白在细胞核和质的分布,结果表明12 h p.i.时,在AcMNPV-Ac132-EGFP处理组中,F-actin就明显出现在细胞核中,一直持续到72 h,比其它处理组明显提前了F-actin在细胞核中的聚集,同时F-actin在细胞膜内侧大量聚集。而在突变型病毒AcMNPV^ac132ko-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP处理组中,F-actin在12-48 h p.i.均集中在细胞膜内侧面,72 h p.i.时在细胞核中大量聚集。AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP处理组和野生型AcMNPV-EGFP处理组中F-actin在细胞核、质中的分布相同,均在12-48 h p.i.逐渐入核,在72 h p.i.时开始出核。AcMNPV-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP处理组中F-actin相比AcMNPV-EGFP处理组提前进核,延迟出核,但是比过表达重组病毒AcMNPV-Ac132-EGFP处理组提前和延迟的程度弱。随后Western blot定量分析了β-actin在细胞核中的聚集情况,结果与荧光定位的结果一致。以上结果说明了Ac132通过不完全依赖核定位信号进入细胞核,并且可以提前纤维状肌动蛋白在细胞核中的聚集,从而促进病毒的增殖。第三部分:重组病毒AcMNPV^ac132ko-EGFP、AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP、AcMNPV-Ac132-EGFP、AcMNPV^ac132ko-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP和AcMNPV-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP对宿主细胞能量代谢的影响我们已经明确了Ac132蛋白对AcMNPV在Sf9细胞中增殖的重要性。AcMNPV的增殖可以激活PI3K-Akt-mTOR信号通路,从而进一步激活与细胞代谢有关的下游信号通路,提高糖酵解水平可以通过PI3K-Akt信号通路激活丙酮酸激酶来实现。那么过表达Ac132的重组病毒又会对Sf9细胞中的糖酵解过程产生怎样的影响?葡萄糖的消耗以及乳酸的积累可以反映糖酵解的水平,因此用5 MOI的AcMNPV^ac132ko-EGFP、AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP、AcMNPV-Ac132-EGFP、AcMNPV^ac132ko-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP和AcMNPV-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP侵染Sf9细胞,检测细胞葡萄糖的消耗和乳酸的积累。结果表明相较于野生型处理组,重组病毒处理组子代病毒增殖能力越强,Sf9细胞消耗葡萄糖的越多,积累的乳酸越多。过表达重组病毒AcMNPV-Ac132-EGFP处理组和AcMNPV-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP处理组中,宿主细胞在12 h p.i.显示出了较高的葡萄糖消耗,分别是野生型AcMNPV-EGFP处理组的1.82倍和1.18倍。同时,在6 h p.i.积累了大量的乳酸,分别是AcMNPV-EGFP处理组的2.66倍和1.42倍,但是之后葡萄糖消耗增加的幅度减缓。在AcMNPV^ac132ko-Ac132-EGFP处理组和野生型AcMNPV-EGFP处理组中,Sf9细胞对葡萄糖的消耗和乳酸的积累大体一致,并在24 h p.i.开始对葡萄糖的需求有较大幅度的增加,并且后续呈缓慢增加的趋势。AcMNPV^ac132ko-EGFP处理组和空白对照组的情况一致,Sf9细胞葡萄糖的消耗持续缓慢增加,几乎不积累乳酸。在AcMNPV^ac132ko-Ac132^{PPKK25-28AAAA}-EGFP处理组中,由于前期子代病毒在缓慢积累,Sf9细胞在24h p.i.开始增加葡萄糖的消耗,乳酸的积累也在缓慢增加,直到72 h p.i.乳酸浓度突然增加,推测是在72 h p.i.子代病毒的积累达到了一定高浓度所致。总之,由于Ac132序列完整性导致的重组病毒对子代病毒增殖的影响可进而影响到Sf9细胞的糖酵解过程,这为进一步明确AcMNPV的关键结构基因对侵染宿主细胞能量代谢的影响提供了线索。本研究在细胞和分子水平上通过构建Ac132的敲除、过表达和突变型的重组病毒株,揭示了AcMNPV中关键结构蛋白Ac132的功能,它依赖自身核定位信号在细胞核中高度积累,通过促进F-actin在细胞核中聚集,提高子代病毒增殖效率,同时也激活了与细胞能量代谢相关的通路,加快糖酵解过程,为病毒的复制、装配和释放提供能量。以上结果为科学利用杆状病毒开展植物虫害生物防治提供了参考。