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目的：
青光眼是严重损害视力的常见致盲眼病,青光眼患者视功能的损害是视神经纤维损伤并导致视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的结果。研究认为,逆行运输阻滞、多种营养因子缺乏、缺血以及兴奋性氨基酸的毒性作用等可能是引发凋亡的因素。因此,治疗青光眼的最终目的是预防视神经的损害和RGCs的凋亡。
目前视神经保护的方法有:(一)改善视乳头微循环,(二)谷氨酸受体拮抗剂的应用,(三)一氧化氮途径抑制剂,(四)提供神经营养因子,(五)抗凋亡治疗,(六)热休克蛋白应用,(七)促红细胞生成素,等。
转化生长因子TGF-β是近年来发现的一个重要的生长因子家族,哺乳动物中TGF-β1含量最高。TGF-β1生物学作用广泛,在胚胎形成、细胞生长、分化、血管形成、肿瘤增殖、伤口愈合、炎症反应及免疫调节等方面都有重要作用。在神经系统中,TGF-β1还具有抑制神经元凋亡,促进神经元轴突生长,促进神经元存活和分化等作用。TGF-β1与其它神经营养因子相互作用可以促进神经元存活。在脑损伤性疾病中,TGF-β1还有充当神经保护剂、抑制细胞凋亡的作用,脑组织缺氧缺血性损伤后,细胞凋亡增加,Bcl-2/Bax比值下降,TGF-β1干预后可调控Bcl-2及Bax蛋白表达,使Bcl-2/Bax比值升高,TGF-β1可以通过增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达,起神经细胞保护作用。目前,已知此保护作用的途径包括降低Ca2+浓度,稳定细胞内钙及增加Bcl-2相关死亡因子Bad磷酸化,减少Bad蛋白表达。
Bcl-2基因家族成员是细胞凋亡途径中的重要调节因子,Bcl-2和Bax调控细胞凋亡,Bcl-2抑制凋亡,Bax促进凋亡。近年研究提示,细胞凋亡不仅取决于Bcl-2和Bax自身表达的高低,还与Bcl-2/Bax的比值有关,细胞内Bcl-2和Bax的比值是决定细胞凋亡与否的一个很敏感的指标,Bcl-2与Bax的比值决定着细胞受诱导刺激后是凋亡还是存活,比值增加,细胞趋于存活,比值下降,细胞趋于凋亡。研究表明,急性高眼压大鼠随着视网膜神经节细胞的凋亡,Bcl-2/Bax下降。目前研究也明确显示,Bcl-2的表达能够阻止或减少视网膜视神经节细胞的凋亡。
Smad蛋白家族是目前发现的TGF-β1唯一的底物,是把TGF-β1受体信号从胞质传导到细胞核内的中介分子。TGF-β1多种功能的发挥均依赖Smad蛋白的信号转导及调控。Smad4在TGF-β1-Smad信号转导中处于中枢环节,能与活化的受体Smads形成多元复合体,通过特定的穿梭机制进入细胞核中与转录激活或转录抑制因子相互作用,进而调节靶基因的表达。
NF-κB又称核转录因子,是一种广泛存在于体内各种细胞的核转导因子。作为一种多向性调节蛋白,NF-κB可以介导细胞存活信号,防止细胞凋亡。各种研究表明,细胞抗凋亡作用的启动信号仍然是各种生存因子通过受体激酶的介导,激发以NF-κB为中心的正向级放大的信号转导通路,促使NF-κB调控的抗凋亡基因如Bcl-2家族成员等的激活及Caspase-9等的凋亡。
目前,国内外尚未有TGF-β1在慢性高眼压大鼠RGCs中的表达以及TGF-β1在青光眼中的抗凋亡作用的研究。为了探讨TGF-β1在青光眼中的表达及其抗凋亡作用途径,本课题应用TGF-β11抗体、TGF-β1抗原分别干预慢性高眼压大鼠,检测视网膜神经节细胞TGF-β1、Bcl-2和Bax的表达,以及检测TGF-β1信号转导途径中Smad4和NF-κB的表达,以期证实TGF-β1在青光眼视网膜神经节细胞中的抗凋亡作用,为青光眼的治疗提供一定依据。
研究方法：
一、TGF-β1在慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞的表达及其抗凋亡作用
采用免疫组化和ReALTime PCR法检测正常组、普通高眼压组、TGF-β1抗体干预高眼压组大鼠RGCs中TGF-β1的表达。采用TUNEL法检测普通高眼压组和TGF-β1抗体干预高眼压组中RGCs凋亡并计数。
二、TGF-β1对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞Bcl-2和Bax表达的影响
采用免疫组化和RealTime PCR法检测正常组、普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组中不同时间段大鼠视网膜神经节细胞Bcl-2和BaX的表达,计算Bcl-2/bax比值,并用TUNEL法检测普通高眼压组和TGF-β1抗原干预高眼压组RGCs凋亡并计数。
三、TGF-β1对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞凋亡调控信号转导途径的探讨
采用免疫组化和RealTime PCR法检测正常组、普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组中不同时间段大鼠视网膜神经节细胞Smad4和NF-κB的表达。
结果：
一、TGF-β1在慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞的表达及其抗凋亡作用
TGF-β1蛋白在正常眼压组、普通高眼压组、TGF-β1抗体干预高眼压组的阳性表达率分别为33.33％、75％、4.17％。普通高眼压组与正常眼压组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);TGF-β1抗体干预高眼压组与正常眼压组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);TGF-β抗体干预高眼压组与普通高眼压组相比,有显著差异(P＜0.01)。
TGF-β1 mRNA相对表达量在正常眼压组、普通高眼压组、TGF-β1抗体干预高眼压组分别为1.19±0.09、6.33±4.81、0.20±0.17。三组中两两比较,均有显著差异(P＜0.01);
视网膜神经节细胞凋亡计数在普通高眼压组、TGF-β1抗体干预高眼压组分别为43.58±24.30和57.47±23.25,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。
TGF-β1在正常眼压组视网膜神经节细胞中有少量表达,此时,视网膜神经节细胞没有凋亡出现。
普通高眼压组,在眼压升高时,TGF-β1的表达出现升高,在前两周时,表达增强显著,两周后TGF-β1的表达逐渐减弱,此时,随着时间的延长,视网膜神经节细胞凋亡越来越严重。
在TGF-β1抗体干预高眼压组,TGF-β1的表达受到抑制,表达显著减弱,此时,随着时间的延长,视网膜神经节细胞凋亡更加严重。
二、TGF-β1对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞Bcl-2和Bax表达的影响
Bcl-2蛋白在正常眼压组、普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组的阳性表达率分别为25％、58.33％、100％。普通高眼压组与正常眼压组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);TGF-β1抗原干预高眼压组与正常眼压组、普通高眼压组相比,均有显著差异(P＜0.01)。
Bax蛋白在正常眼压组、普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组的阳性表达率分别为20％、87.5％、33.33％。普通高眼压组与正常眼压组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);TGF-β1抗原干预高眼压组与正常眼压组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);TGF-β1抗原干预高眼压组与普通高眼压组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。
Bcl-2mRNA相对表达量在正常眼压组、普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组分别为1.54±0.34、5.00±1.85、32.09±13.38。三组中两两比较,均有显著差异(P＜0.01);
BaxmRNA相对表达量在正常眼压组、普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组分别为1.27±0.16、6.51±2.43、2.09±0.76。普通高眼压组与正常眼压组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);TGF-β1抗原干预高眼压组与正常眼压组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);TGF-β1抗原干预高眼压组与普通高眼压组相比,差异有统计学意义(P＜0.01)。
正常眼压组、普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组Bcl-2/bax值分别为1.25±0.39、0.87±0.46、19.86±6.75。三组中两两比较,均有显著差异(P＜0.01);
视网膜神经节细胞凋亡计数在普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组分别为43.58±24.30和15.52±9.01,两组比较,有显著差异(P＜0.01)。
Bcl-2、Bax蛋白在正常眼压组视网膜神经节细胞中有少量表达,此时,视网膜神经节细胞没有凋亡出现。
在普通高眼压组,当眼压升高时,Bcl-2蛋白的表达出现轻度升高,两周时达到高峰,随后下降,而Bax蛋白的表达则是随着时间延长而逐渐增强,Bcl-2/Bax的比值也越来越小。此时,随着时间的延长,视网膜神经节细胞凋亡越来越严重。
在TGF-β1抗原干预高眼压组,Bcl-2蛋白的表达显著增强,到两周时达到高峰,然后随时间延长,逐渐减弱。而Bax的表达则是越来越弱,两周后达到最低,并随着时间延长而逐渐缓慢增强。Bcl-2/Bax的比值在TGF-β1抗原干预高眼压组显著增加。在TGF-βl抗原干预高眼压组,视网膜神经节细胞凋亡明显减轻。
三、TGF-β1对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞凋亡调控信号转导途径的探讨
Smad4蛋白在正常眼压组、普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组的阳性表达率分别为25％、62.5％、95.8％。普通高眼压组与正常眼压组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);TGF-β1抗原干预高眼压组与正常眼压组、普通高眼压组相比,均有显著差异(P＜0.01)。
NF-κB蛋白在正常眼压组、普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组的阳性表达率分别为33.33％、66.67％、100％。普通高眼压组与正常眼压组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);TGF-β1抗原干预高眼压组与正常眼压组、普通高眼压组相比,均有显著差异(P＜0.01)。
Smad4mRNA相对表达量在正常眼压组、普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组分别为1.74±0.5、32.84±0.63、15.39±4.54。三组中两两比较,均有显著差异(P＜0.01);
NF-κBmRNA相对表达量在正常眼压组、普通高眼压组、TGF-β1抗原干预高眼压组分别为3.70±1.19、32.37±12.01、1365.60±732.22。三组中两两比较,均有显著差异(P＜0.01);
Smad4、NF-κB蛋白在正常眼压组视网膜神经节细胞中有少量表达。
在普通高眼压组,当眼压升高时,Smad4、NF-κB蛋白的表达出现轻度升高,两周时达到最大,随后逐渐下降。
在TGF-β1抗原干预高眼压组,Smad4、NF-κB蛋白的表达显著增强,到两周时达到高峰,然后随时间延长,逐渐减弱。
在普通高眼压组和TGF-β1抗原干预高眼压组,Smad4、NF-κB蛋白表达与Bcl-2、Bax蛋白在两组中的表达相对一致。
结论：
1、TGF-β1可能作为一种神经营养因子或者抗凋亡因子可以抑制视网膜神经节细胞的凋亡。
2、在高眼压大鼠视网膜神经节细胞中,Bcl-2蛋白表达相对增强,可以抑制视网膜神经节细胞的凋亡;Bax蛋白的表达相对增强,可以促进视网膜神经节细胞的凋亡。Bcl-2/Bax比值升高,视网膜神经节细胞的凋亡计数降低,Bcl-2/Bax比值降低,视网膜神经节细胞的凋亡计数升高。
在高眼压大鼠视网膜神经节细胞中,TGF-β1可以通过提高Bcl-2蛋白表达,降低Bax蛋白表达,促进Bcl-2/Bax比值升高,抑制视网膜神经节细胞的凋亡。
3、提示Smad4、NF-κB参与了TGF-β1干预高眼压组调控Bcl-2、Bax表达的信号转导过程。