目的本研究通过2X2析因设计,评价杞精明目汤及结膜胶原交联(CXL)对结膜胶原蛋白的影响;杞精明目汤联合结膜CXL治疗结膜松弛症(CCh)的效果。同时通过2X2析因设计,在动物模型中验证杞精明目汤及结膜胶原交联(CXL)对结膜胶原蛋白的影响。方法1.164名CCh患者随机分成4组(每组41人):对照组、中药组、CXL组、中药+CXL组。对照组仅手术切除松弛结膜,不施加中药及CXL干预;中药组给予杞精明目汤颗粒制剂口服;CXL组行结膜CXL;中药+CXL组接受口服杞精明目汤颗粒制剂和结膜CXL。3月后切除松弛结膜组织。试验前及试验后3个月,分别对四组进行OSDI量表积分和中医证候积分变化评分,并以OSDI评分进行疗效评价;OCT及共聚焦显微镜检查;切除结膜组织的HE染色、Masson染色和透射电镜病理观察;切除结膜组织中胶原蛋白RT-PCR、Western blot和免疫组织化学检测。2.40只新西兰大白兔结膜松弛造模成功后随机分成4组(每组10只):对照组、中药组、CXL组、中药+CXL组。对照组无干预;中药组给予杞精明目汤灌胃;CXL组给予结膜CXL;中药+CXL组给予杞精明目汤灌胃和结膜CXL。3月后切除结膜组织。在实验前及实验后3个月,分别进行OCT及共聚焦显微镜检查;切除结膜组织的HE染色、Masson染色和透射电镜病理观察;切除结膜组织中胶原蛋白RT-PCR、Western blot和免疫组织化学检测。结果第一部分 临床试验本研究纳入病例的一般资料如年龄、性别、眼别、病情、病程组间均衡。1.疗效指标1.1 OSDI量表积分:对照组、中药组、CXL组、中药+CXL组治疗前4组均衡,治疗后4组之间差异有统计学意义(F=30.58,P<0.001),治疗后根据主效应检验及疗效评价从高到低依次为:中药+CXL组>中药组>CXL组>对照组。1.2 中医证候积分:对照组、中药组、CXL组、中药+CXL组治疗前4组均衡,治疗后4组之间差异均有统计学意义(F=18.04,P<0.001)。治疗后根据主效应检验及疗效指标优劣从高到低依次为:中药+CXL组≥中药组>CXL组>对照组。2.临床指标2.1 人眼球结膜OCT成像测量球结膜厚度显示:四组随访前至随访3个月球结膜上皮层厚度差异无统计学意义(F=0.054,P=0.984),但球结膜固有层厚度(F=51.064,P<0.001)和全层厚度(F=42.084,P<0.001)差异均有统计学意义。随访1、2、3月时四组球结膜固有层厚度和全层厚度差异均有统计学意义(P<0.001)。随访1、2、3月时四组间球结膜固有层厚度和全层厚度LSD多重比较及主效应检验显示中药+CXL组及CXL治疗两组厚度显著高于对照组及中药组。2.2 共聚焦显微镜:对照组球结膜固有层胶原纤维排列稀疏;中药组球结膜固有层中胶原纤维排列松散、紊乱;CXL组和中药+CXL组球结膜固有层胶原纤维排列较对照组致密。3.实验指标3.1 HE染色和Masson染色:对照组球结膜固有层胶原纤维排列稀疏、紊乱;中药组球结膜固有层中胶原纤维排列松散,细胞数量较对照组略增多;CXL组和中药+CXL组球结膜固有层胶原纤维排列较对照组致密,细胞量更多。3.2 透射电镜检查通过Image-Pro-Plus 6.0图像分析系统对结膜胶原纤维直径进行测量:对照组与CXL组、中药+CXL组比较差异有统计学意义(P<0.001),中药组与CXL组、中药+CXL组间差异有统计学意义(P<0.001)。主效应检验显示,采用CXL治疗胶原纤维直径值有明显变化。3.3 RT-PCR检测显示:Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的相对表达含量,四组之间差异有统计学差异(FⅠ=213.029,FⅢ=887.175,P<0.001);四组间比较显示,对照组与CXL组相比差异无统计学意义,其他组间比较均有统计学差异(P<0.001)。单独效应检验显示,采用中药治疗能增加Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的相对表达含量,中药联合CXL治疗更明显。3.4 WB检测显示:Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的相对表达含量,四组之间差异有统计学意义(FⅠ=278.85,FⅢ=79.32,P<0.001);四组间比较各组之间均有统计学差异(P<0.01)。主效应及单独效应检验显示,采用中药及CXL治疗均能增加Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的相对表达含量,中药联合CXL治疗更明显。3.5 免疫组化使用Image-Pro-Plus 6.0图像分析系统对染色结果分析得到结膜组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白染色光密度值:四组眼结膜样本中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白平均光密度值差异有统计学意义(FⅠ=166.426,FⅢ=170.78,P<0.001);四组间比较,对照组与中药组、中药+CXL组比较差异均有统计学意义(P<0.001),CXL组与中药组、中药+CXL组比较差异均有统计学意义(P<0.001),而对照组与CXL组、中药组与中药+CXL组之间差异无统计学意义(P>0.05)。主效应检验显示,采用中药及中药联合CXL治疗变化明显。第二部分动物实验本研究纳入造模成功后动物一般资料如年龄、性别、病情、病程组间均衡。1.兔眼球结膜OCT成像测量球结膜厚度显示:四组干预前至干预3个月分别测量球结膜上皮层厚度差异无统计学意义(F=0.506,P=0.681),但固有层厚度(F=8.859,P<0.001)和全层厚度(F=7.703,P<0.001)差异均有统计学意义。干预1、2、3月时四组球结膜固有层厚度和全层厚度差异均有统计学意义(P<0.001)。干预1、2、3月时四组间球结膜固有层厚度和全层厚度LSD多重比较及主效应检验显示中药+CXL组及CXL治疗两组厚度显著高于对照组及中药组(P<0.001)。2.共聚焦显微镜:对照组结膜固有层纤维排列紊乱,中药组结膜固有层胶原纤维含量增多,CXL组较对照组更紧密,CXL+中药组结膜固有层纤维排列更为紧密。3.HE染色及Masson染色观察显示:对照组结膜胶原纤维排布松散,偶有断裂情况,中药组结膜组织胶原纤维增多,CXL组胶原纤维排布较密,胶原纤维较粗,中药+CXL组胶原纤维含量较多,胶原纤维排布紧密,胶原纤维粗。4.透射电镜检查通过Image-Pro-Plus 6.0图像分析系统对结膜胶原纤维直径进行测量:对照组与CXL组、中药+CXL组比较差异有统计学意义(P<0.001),中药组与CXL组、中药+CXL组间差异有统计学意义(P<0.001)。主效应检验显示,采用CXL治疗胶原纤维直径值有明显变化。5.RT-PCR检测显示:Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的相对表达含量,四组之间差异有统计学差异(FⅠ=2182.228,FⅢ=1029.534,P<0.001);四组间比较显示,对照组与CXL组相比差异无统计学意义(P>0.05),其他组间比较均有统计学差异(P<0.001)。单独效应检验显示,采用中药治疗能增加Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的相对表达量,中药联合CXL治疗更明显。6.WB检测显示:Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的相对表达含量,四组之间差异有统计学意义(FⅠ=104.81,FⅢ=83.55,P<0.001);四组间比较显示,除Ⅰ型胶原蛋白的相对表达含量中药组与中药+CXL组比较差异无统计学意义(P>0.05),其他各组间Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的相对表达含量差异均有统计学意义(P<0.01)。主效应及单独效应检验显示,采用中药治疗能增加Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的相对表达含量,中药联合CXL治疗更明显。7.免疫组化使用Image-Pro-Plus 6.0图像分析系统对染色结果分析得到结膜组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白染色光密度值:四组眼结膜样本中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白平均光密度值差异有统计学意义(FⅠ=331.077,FⅢ=207.257,P<0.001);四组间比较,对照组与CXL组比较、中药组和中药+CXL组比较差异无统计学意义(P>0.05),其余各组两两比较均有统计学意义(P<0.001)。主效应检验显示,采用中药治疗能增加Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达量,中药联合CXL治疗更明显。结论1.杞精明目汤和结膜胶原交联均可以改善结膜松弛症患者的症状;2.杞精明目汤可以增加结膜组织胶原蛋白的相对表达含量,胶原交联运用于结膜组织,可增加结膜胶原纤维的直径;3.胶原蛋白可以作为结膜松弛症治疗的新靶点;4.杞精明目汤可以上调结膜组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达,可能是其治疗结膜松弛症的作用机制之一;5.杞精明目汤联合结膜胶原交联可更有效的治疗结膜松弛症。