目的:(1)表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)的分离、培养和鉴定。(2)探索通过过表达细胞周期蛋白D1(CCND1)诱导成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞,观察去分化后细胞的形态、表型、增殖情况的改变。(3)探索过表达CCND1诱导后的表皮细胞对裸鼠皮肤创面修复的促进作用。方法:(1)取包皮过长病人术后的新鲜成人包皮组织,去除皮下的软组织。分别经分解酶(DispaseⅡ)和胰蛋白酶消化,200目滤网过滤。用Epilife完全培养基将分离的细胞重悬,接种于Ⅳ型胶原包被的培养瓶中。30min后换液,PBS冲洗掉尚未贴壁的表皮细胞,重新加入Epilife培养基放入培养箱培养。免疫细胞荧光技术检测该细胞的表皮干细胞抗体CK19、β1和成熟表皮细胞抗体CK10的表达情况。(2)将质粒PEGFP-N1和细胞周期蛋白D1(CCND1)基因合成表达质粒PEGFP-N1-CCND1,并通过Lipofectamine?2000转染成熟表皮细胞,造成成熟表皮细胞CCND1基因过表达。设PEGFP-N1-CCND1转染后的表皮细胞为实验组,表皮干细胞为阳性对照组,空载体PEGFP-N1转染的表皮细胞为阴性对照组。转染后通过细胞计数板记录各组细胞5d时细胞数量的变化。通过RT-PCR检测各组细胞的表皮细胞标志抗原CK19、β1和成熟表皮细胞标志抗原CK10在m RNA水平的表达情况。Western Blot技术检测各组细胞的表皮细胞标志抗原CK19、β1和成熟表皮细胞标志抗原CK10在蛋白水平的表达情况。细胞免疫荧光技术检测各组细胞的表皮干细胞标志抗原CK19、β1和成熟表皮细胞标志抗原CK10在各组细胞内的蛋白表达的变化情况。(3)将30只裸鼠随机分成3组,按所移植的各组细胞对应将三组裸鼠分为实验组、阳性对照组和阴性对照组,每组10只。用2%水合氯醛0.1ml/20g的量小鼠腹腔注射麻醉[1,2],每只裸鼠背上做一个直径6mm的全层切割伤。用hoescht33342将实验组、阳性对照组和阴性对照组的细胞染色后,按每只鼠5×106个的量与0.05ml的基质胶混匀,种于裸鼠创面。观察10d、20d各组裸鼠伤口愈合情况。同时切下裸鼠创面,通过冰冻切片的免疫荧光技术追踪人表皮细胞在裸鼠创面的位置和生长情况。结果:(1)镜下观察表皮干细胞悬液种于Ⅳ型胶原包被的培养瓶中30min后,部分细胞贴壁并长出小触手。因为表皮干细胞对Ⅳ型胶原亲和力更强,这时贴壁的是表皮干细胞,PBS洗掉没有贴壁的表皮细胞,加入培养基继续培养。表皮干细胞胞体小,胞核大,呈团块状生长,增殖迅速,细胞密度较大,等细胞铺满培养瓶后,细胞间几乎没有间隔。细胞免疫荧光技术检测结果显示:表皮干细胞标志蛋白CK19、β1荧光表达阳性,成熟表皮细胞标志蛋白CK10荧光表达阴性。(2)表皮干细胞培养5-6代以后胞体变大,胞核变小,核浆比减小,细胞增殖缓慢甚至停滞。PEGFP-N1-CCND1转染后的表皮细胞包体变小,胞核增大,核浆比增大,细胞呈团块状生长,增殖迅速,迅速铺满培养瓶。细胞免疫荧光技术检测结果显示:实验组细胞和阳性对照组的表皮干细胞标志蛋白CK19、β1荧光表达阳性,成熟表皮细胞标志蛋白CK10荧光表达阴性;阴性对照组表皮干细胞标志蛋白CK19、β1荧光表达阴性,成熟表皮标志蛋白CK10荧光表达阳性。RT-PCR技术和Western Blot技术检测显示在m RNA水平和蛋白水平上:实验组细胞和阳性对照组CK19、β1表达阳性,CK10表达阴性;阴性对照组CK19、β1表达阴性,CK10表达阳性。实验组细胞和阳性对照组细胞5d后细胞数量明显多于阴性对照组细胞。(3)裸鼠移植后伤口愈合情况:10d后实验组和阳性对照组裸鼠伤口面积较阴性对照组小;20d后实验组和阳性对照组裸鼠伤口面积较阴性对照组小。冰冻切片免疫荧光显示实验组和阳性对照组裸鼠创面CK19和β1表达阳性,CK10表达阴性;阴性对照组裸鼠创面CK19和β1表达阴性,CK10表达弱阳性。结论:(1)利用表皮干细胞和表皮层的其他细胞与Ⅳ型胶原亲和力的不同可以分离获取表皮干细胞,并且纯度较高。(2)通过脂质体将PEGFP-N1-CCND1转入成熟表皮细胞,过表达CCND1的方法可以诱导成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞。(3)PEGFP-N1-CCND1诱导去分化后的表皮细胞具备表皮干细胞类似的具有促进裸鼠创面愈合的能力。