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大鼠是生命科学研究中常用的实验动物之一,大鼠体外受精技术的发展不仅有利于大鼠种质资源保存,而且还可推动受精分子机制、胚胎发育及生殖毒理等生殖生物学领域的深入研究,具有重要的实用价值和理论意义。本试验主要以SD大鼠为研究对象,对其超数排卵、体外受精、胚胎体外培养及胚胎移植等技术进行探讨,实验内容和结果如下:
1.观察了不同剂量水平的PMSG/hCG对幼龄大鼠的超数排卵效果。结果表明,4~5周龄组SD大鼠在激素剂量为20 IU/只时,平均超排采卵54.6枚,明显高于其他剂量组;6~7周龄组在激素剂量为40 IU/只时超排采卵数最多,为32.7枚,但与30 IU和50 IU剂量组差异不明显;8~9周龄组超排效果最差,用不同剂量超排最高平均采卵21.5枚。本试验表明,SD大鼠的超排效果随着年龄增长而下降,4~5周龄雌鼠超排效果最好,其中激素剂量为20 IU/只时超排采卵数最多。
2.采用阴道涂片检查的方法对大鼠发情周期的不同阶段进行观察,分析各个发情周期阴道上皮细胞的变化情况。结果发现,发情周期的不同阶段,阴道上皮细胞类型呈规律性变化:发情前期的阴道涂片以椭圆形的有核上皮细胞占绝大多数;发情期的阴道涂片以片状的,角质化上皮细胞占绝大多数;发情后期的阴道涂片,片状角质化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞同时存在,且比例相当;发情间期的阴道涂片以白细胞占绝大多数。
3.对大鼠进行胚胎移植研究,比较了自然排卵和超数排卵所得卵子的质量差异。结果显示,经超排处理的2-细胞胚胎在移植给受体后,妊娠率为63.3%,自然排卵组的妊娠率为60%,统计学差异不显著。
4.选用mKRB、IVF30和mR1ECM-BSA作为精子获能液和体外受精液,对SD大鼠进行体外受精。结果表明,用IVF30培养液对SD大鼠进行IVF可以获得73.8%的2-细胞卵裂率,显著高于mR1ECM-BSA组和mKRB组(分别为13.5%和21.1%)。
5.选定IVF30为精子获能液和体外受精液,对影响体外受精的一些关键因素如精子获能时间,注射hCG后收集卵子的时间,以及精子与卵子的共孵育时间进行研究。结果发现,在IVF30培养液中,大鼠精子不经获能也可以使卵子受精(受精率为33.8%),但受精率在一定范围内随着获能时间的延长呈上升趋势,在获能7 h时受精率最高,为83.2%,明显高于其他各组,继续获能9 h后再与卵子相遇则受精率下降;注射hCG后13h收集卵子进行体外受精,受精率最高,为88.6%,继续推迟采卵时间,则受精率下降;精卵相互作用6、9、12 h后的2-细胞卵裂分别为70.9%、78.6%和73.8%,统计学差异不显著;
6.主要研究了BSA、PVA及葡萄糖浓度对大鼠胚胎体外发育的影响。结果发现,BSA和PVA对受精卵至4-细胞期前的发育差异不显著,但PVA的添加似乎更支持4-细胞期以后的胚胎发育,21.4%的胚胎能够发育到囊胚,而BSA组则没有胚胎发育到囊胚;不同浓度葡萄糖对大鼠受精卵体外培养的结果显示,0.2mM组的囊胚发育率为仅为4.1%,显著低于5.5 mM组和7.5 mM组(23.5%和21.4%),而5.5 mM组和7.5mM组的囊胚发育率不显著。
7.用IVF30对更多品系大鼠进行体外受精试验,并对体外受精所得2-细胞胚胎进行了体内移植。结果表明,IVF30不仅适合用作SD大鼠的精子获能和体外受精液,在Wistar、GK和F344大鼠也可以获得比较高的体外受精率(分别为72.6%、87.8%和71.6),GK大鼠的体外受精率甚至高于SD大鼠(为83.2%),但四个品系的体外受精率差异均不显著;胚胎移植的结果显示,IVF所得2-细胞移植后能够妊娠并产仔,产仔率为12.5%,但明显低于对照组(60%)。