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前言： 支气管哮喘(bronchial asthma)(以下简称哮喘)是常见的呼吸系统疾病，已成为严重的社会健康问题，迄今为止，哮喘的发病机制尚未完全清楚，但气道炎症、气道高反应性及气道重塑是目前公认的哮喘的三大特征，其中气道重塑可导致不可逆的通气功能障碍、持续性气道反应性增高、对支气管舒张剂敏感性减退等，是出现重症或难治性哮喘的重要原因。气道平滑肌细胞(airway smooth musclecells，ASMCs)作为导致气道狭窄的主要效应细胞，其异常增殖、凋亡及迁移均能引起气道壁增厚，它也可以通过释放多种炎性介质加重气道炎症，因此ASMCs是气道重塑研究中的重要成员，有效抑制ASMCs异常增殖、凋亡将会减轻哮喘气道重塑。 血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)作为抑制性非肾上腺素能非胆碱能(inhibitory non-adrenergic non-cholinergic，i-NANC)神经肽，最初单纯被认为是一种胃肠激素，调节消化系统生理活动，随着研究的不断深入，逐渐认识到VIP在神经-内分泌-免疫反应中发挥着更重要的生物学作用，参与多种生物学效应，如代谢过程、细胞分化、平滑肌松弛、免疫反应的调节及免疫稳态的维持等，现研究认为VIP与哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺动脉高压、脓毒症休克、糖尿病、风湿病、学习与记忆、多发性硬化等疾病有关。 ERK1/2信号通路是MAPKs的家族成员，是把细胞外信号转导到核内调控基因表达的重要细胞内信号分子，是不同促增殖因子调控的共同通路，在气道平滑肌上分布广泛，主要存在ERK1、ERK2两种亚型，磷酸化ERK1/2参与ASMCs增殖，对哮喘气道重塑有调节作用。小窝蛋白-1(Caveolae-1，Cav-1)存在于ASMCs表面，参与调节细胞周期与信号转导，在细胞凋亡程序中也发挥着重要作用，具有抗血管新生、负性调节生长因子作用，对血小板源性生长因子(Platelet derivedgrowth factor, PDGF)的负向调控可导致平滑肌细胞由增殖转向凋亡。 研究已证实VIP具有支气管扩张、抗炎及抑制平滑肌细胞(smooth muscle cells，SMCs)增殖作用，目前相关VIP与气道炎症、气道高反应性以及其抑制血管平滑肌细胞增殖的研究较多，而VIP对哮喘ASMCs作用及机制的研究极少。且目前临床上对哮喘的治疗多集中于气道炎症控制和喘息症状缓解上，但不能有效的控制气道重塑进展。 本研究通过卵蛋白致敏及雾化激发的方法构建哮喘小鼠气道重塑模型，体内实验观察肺组织VIP及受体VIPR1表达的变化以及给予VIP治疗后对气道重塑的影响;并进行体外ASMCs培养，给予不同浓度VIP以及改变VIP作用时间，分别观察VIP对哮喘气道重塑小鼠ASMCs增殖的影响;选择VIP对ASMCs的最佳作用时间及干预浓度，探讨VIP通过ERK1/2信号通路对ASMC增殖作用的影响，为哮喘的治疗提供新的思路。 材料和方法： 一、实验材料 1、实验动物 6～8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠(18～22g)，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。 2、主要试剂 卵蛋白（美国Sigma公司） 氢氧化铝粉末（上海美兴化工股份有限公司） VIP(美国Sigma公司) [D-p-Cl-Phe6,Leu17]-VIP(TOCRIS公司) 兔抗小鼠VIP、VIPR1多克隆抗体（北京博奥森公司） DMEM高塘培养基(Gibco公司) Ⅰ型胶原酶(Invitrogen公司) 木瓜蛋白酶（上海生工生物工程有限公司） 胰酶（碧云天公司） 胎牛血清（Hyclone公司） RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所） ECL发光液(Thermo公司) PVDF膜(Millipore公司) IL-13（美国PeProTech公司） Trizol裂解液(Takara，宝生物工程有限公司) 反转录试剂盒(Takara，宝生物工程有限公司) Real-time PCR试剂盒(Takara，宝生物工程有限公司) MTT试剂盒（美国Sigma公司） 二、实验方法 1、哮喘气道重塑小鼠肺组织VIP与受体VIPR1表达的变化及对气道重塑的影响 哮喘小鼠模型制作:动物适应性喂养1周后，第0、7和14天无菌条件下腹腔注射致敏液0.2ml(含OVA100μg+氢氧化铝粉末1mg)，第21天开始雾化激发:将小鼠置于自制雾化容器中(20cm×20cm×20cm)，雾化吸入2％ OVA溶液，每次30min，隔天1次，共8周，对照组以PBS进行腹腔注射及雾化吸入。 实验分三组:正常对照组、哮喘模型组、VIP治疗组，每组8只。其中VIP治疗组在每次雾化激发前半小时给予VIP150μg/kg腹腔注射。 应用肺组织石蜡切片HE染色观察各组小鼠肺组织病理变化，应用病理图像分析系统检测气道重塑。免疫组化及real-time PCR方法检测各组肺组织VIP及VIPR1表达。 2、体外实验研究VIP对IL-13诱导的哮喘小鼠ASMCs增殖的影响 哮喘气道重塑组小鼠造模后，进行ASMCs培养，观察VIP对IL-13诱导的ASMCs增殖的影响。 ①MTT法确定VIP的最佳作用浓度及时间 实验分组:ASMCs ASMCs+VIP(10-5rnM) ASMCs+VIP(10-6mM) ASMCs+VIP(10-7mM) ②VIP对IL-13诱导的ASMCs增殖的影响 实验分组:ASMCs ASMCs+IL-13(10-5g/L) ASMCs+IL-13(10-5g/L)+VIP(10-6mM) ASMCs+IL-13(10-5g/L)+ VIP(10-6mM)+[D-p-Cl-Phe6,Leu17]-VIP(10-6mM) 应用MTT法检测各组细胞增殖及流式细胞仪检测细胞周期。 3、ERK1/2信号通路/Cav-1在VIP对IL-13诱导的ASMCs增殖中的作用 实验分组:ASMCs ASMCs+IL-13(10-5g/L) ASMCs+IL-13(10-5g/L)+VIP(10-6mM) ASMCs+IL-13(10-5g/L)+VIP(10-6mM)+PD98059 ASMCs+IL-13(10-5g/L)+VIP(10-6mM)+β-CD ASMCs+IL-13(10-5g/L)+ VIP(10-6mM)+[D-p-Cl-Phe6,Leu17]-VIP(10-6mM) 应用MTT法检测各组细胞增殖及流式细胞仪检测细胞周期;Western blot方法检测p-ERK1/2、 ERK1/2、 Cav-1表达。 结果： 1、哮喘气道重塑小鼠肺组织VIP与受体VIPR1表达及体内实验观察VIP对气道重塑的影响 雾化激发8w小鼠肺组织HE染色可见肺组织有炎细胞浸润，纤毛及上皮细胞脱落，气道平滑肌层增厚，血管平滑肌层增厚，部分肺泡结构破坏的气道重塑的病理改变，应用病理图像分析得出哮喘组气道平滑肌层较正常对照组增厚，而VIP治疗组病理改变较哮喘组轻。 肺组织免疫组化检测VIP及VIPR1蛋白表达及Real-time PCR检测VIP及VIPR1 mRNA表达，得出哮喘组较正常对照组表达均明显减少。 2、体外实验研究VIP对IL-13诱导的哮喘小鼠ASMCs增殖的影响 体外IL-13与ASMCs共培养，MTT法检测各组细胞增殖情况得出，IL-13在体外可诱导ASMCs发生增殖，而VIP干预组细胞增殖减弱，提示VIP可抑制体外IL-13诱导的ASMCs增殖，且此抑制作用与VIP的作用时间及作用浓度有关。 应用流式细胞仪检测各组细胞周期变化，得出VIP可影响ASMCs的细胞周期，使大部分细胞处于G0/G1期，S期比例降低，从而抑制ASMCs增殖。 3、ERK1/2信号通路/Cav-1在VIP对IL-13诱导的ASMCs增殖中的作用 体外应用IL-13诱导ASMCs增殖，并给予干预因素，Western blot检测蛋白表达，结果表明，哮喘ASMCs Cav-1表达减少，p-ERK1/2比例增加;VIP治疗组Cav-1表达增加，p-ERK1/2比例降低;PD98059阻断ERK1/2信号通路后，Cav-1表达增加，p-ERK1/2比例降低。提示VIP抑制体外培养的IL-13诱导的ASMCs增殖作用与ERK1/2信号通路及Cav-1蛋白表达有关。 结论： 1、哮喘气道重塑小鼠肺组织VIP及VIPR1蛋白及mRNA表达均明显减少，给予VIP治疗可在一定程度上减轻气道平滑肌增厚。 2、VIP可以抑制体外培养的ASMCs增殖，且与其作用浓度及时间相关。 3、VIP可通过影响ASMCs细胞周期而抑制其增殖。 4、VIP可能通过抑制ERK1/2信号通路磷酸化及促进ASMCs上Cav-1表达发挥抗ASMCs增殖作用。