近年来，人们不断寻找有效的治疗和预防再狭窄的药物和方法。药物洗脱支架，由于其在靶血管较高的药物浓度，缓慢释放性，较低全身副作用，成为近期的研究热点。 目前在国内外已经有多种药物洗脱支架应用于临床，主要包括抗血栓药物如肝素洗脱支架、抗炎症药物支架如地塞米松洗脱支架、抗增生药物支架如紫杉醇和雷帕霉素。动物实验表明除抗增殖药物外，其他药物支架并没有明显减轻血管内膜增生的作用，雷帕霉素和紫杉醇洗脱支架均显示出良好的减少支架后再狭窄的性能，这些结果都为开发新型药物洗脱支架药物提供了借鉴。中药具有来源广泛、价格低廉、副作用少等优点，随着分子生物学及细胞生物学技术的发展，对中药的有效成分研究得更加透彻，对中药的药理作用已经研究到分子、基因水平，为我们提供了有的放矢地选择可以有效防治再狭窄的中药用于药物洗脱支架的契机。通过对中药防治再狭窄的相关文献的复习，我们选取了青蒿素(artemisinin,Art)，白藜芦醇(resveratrol，Res)及雷公藤甲素(triptolid，Tri)等中药提纯物进行了体外细胞研究，并从中筛选出雷公藤甲素制作药物洗脱支架进行在体防治再狭窄的实验研究。 一、中药抑制平滑肌细胞增殖的体外实验通过体外培养大鼠主动脉平滑肌，应用青蒿素、白藜芦醇、雷公藤甲素等中药进行干预，观察其对于平滑肌增殖作用的影响，筛选阳性结果的中药制作洗脱支架用于体内实验。 (一)细胞培养贴块法培养大鼠主动脉平滑肌(VSMC)。引颈处死大鼠，无菌操作下迅速取出胸主动脉，纵向切开，钝性去除内外膜，剪成1mm3组织块，接种于25ml培养瓶，放入37℃，5％CO2培养箱中，组织块贴壁后加入含20％胎牛血清的RPMI1640培养液，静止培养。7～12天可见VSMC由组织块边缘爬出，覆盖大部分表面时传代。实验用第4～6代细胞。光镜下VSMC呈极性生长，典型“峰”、“谷”排列。 (二)实验分组分为不同浓度Art组和对照组。0.25％胰蛋白酶消化VSMC，用10％FCSRPMI1640培养液配成单细胞悬液，以每孔103～104接种于96孔培养板中，每孔200μl，培养3天。再分别加入不同浓度的Art(10，20，40，80，160mg/l)，Res(4.0×10-5，8.0×10-5，1.2×10-4，1.6×10-4，2.0×10-4mol/l)，Tri(2.5×10-6，5×10-6，1×10～，2×10-5，4×10-5g/l)，孵育24h。每个浓度设5个复孔。 (三)Art，Res，Tri对VSMC增殖的影响每孔加入MTT溶液20μl，继续孵育4h。弃上清液，再加入150μlDMSO,振荡10min，于酶标仪570nm波长处测其吸光度值(A)。各组每天取1块培养板测定A值，最后以时间为横轴，A为纵轴绘制生长曲线。结果表明，对照组细胞生长曲线近似“S”形，Art在10～160mg/l浓度范围内可抑制VSMC的增殖，；Res在4.0×10-5-2.0×10-4mol/1浓度范围内可抑制VSMC的增殖；Tri各浓度对细胞生长均有明显抑制作用(P＜001)，生长曲线不同程度的压低。其细胞计数与对照组相比有明显差异(P＜0.05)，且呈剂量依赖性。 (四)Art，Res，Tri对VSMCDNA合成的影响细胞收集前6～8h每孔加入3H-TdR10μl。0.25％胰蛋白酶消化，用多头微量细胞收集器将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，80℃烘干，闪烁液中静置24h后，用液体闪烁记数器测定每份样品每min脉冲数(cpm)。以每105细胞的cpm值计算DNA合成量。结果表明，Art，Res，Tri可明显抑制体外培养的VSMC3H-TdR的掺入，并随药物剂量加大而抑制作用增强，呈明显的剂量依赖关系。 (五)Art，Res，Tri对VSMC凋亡的影响单细胞悬液800r/min低速离心5min，再加少许温Hanks液，吸管吹打均匀后，涂片晾干固定，HE染色观察凋亡细胞。结果表明，HE染色对照组中无凋亡细胞，Art组可见较多凋亡细胞，细胞核固缩深染，核碎裂并呈数个深蓝色颗粒。单细胞悬液3000r/min离心5min，收集细胞，酚氯仿提取DNA，琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察凋亡细胞DNA梯带。琼脂糖凝胶电泳时对照组无DNA梯形条带，Art组出现细胞DNA梯形条带，且辉光强度随药物浓度增大而变强，提示随药物浓度增大VSMC凋亡程度加重。单细胞悬液800r/min低速离心5min，加入碘化丙啶(PI)液染色，4℃避光放置30min，经300目尼龙膜过滤，在流式细胞仪上测量滤液中细胞DNA变化。结果显示对照组凋亡率为0.10％，Art(40mg/l)组凋亡率为12.93％，Art(160mg/l)组凋亡率为38.72％，Res(4.0x10-5mol/l)组凋亡率为4.4％，Res(2.0x10-4mol/l)组凋亡率为35.8％，Tri(1×10-5g/l)组凋亡率为9.23％，Tri(4×10-5g/1)组凋亡率为27.45％。 (六)Art，Res，Tri对VSMC细胞周期的影响单细胞悬液800r/min低速离心5min，加入碘化丙啶(PI)液染色，4℃避光放置30min，经300目尼龙膜过滤，流式细胞仪测定细胞周期。经Art处理后VSMC细胞周期分布与对照明显不同，各期细胞数占细胞总数的百分率见表。与对照组相比，Art组在培养48h后，细胞的生长被阻滞于G0/G1期，减少了进入S期的细胞比例，并干扰了细胞由S期至G2/M期的发展。而且随药物浓度的增加，该作用更加明显。Tri组Go/G1期细胞的分率较对照组低，S期细胞的百分率分别较对照组高，G2+M期细胞的百分率分别较对照组低。与对照组相比，在加药培养48h后，可显著增加进入S期的细胞比例，各用药组与对照组相比P＜005；同时还可显著减少进入G2+M期的细胞比例，而且随药物浓度的增加，G2+M期细胞比例逐渐减少。 (七)结论以上实验观察了青蒿素、白藜芦醇及雷公藤甲素对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖、DNA合成及细胞周期的影响，证实了上述三种药物对平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用，为下一步药物洗脱支架所载药物的选择提供了实验依据。 二、雷公藤药物洗脱支架的制备及药物释放研究(略） 三、雷公藤药物洗脱支架的在体动物实验研究 (一)实验动物的选择猪的冠状动脉在大小，进入路径、对损伤反应方面与人类相似，故选用健康的实验用小型猪。 (二)小型猪冠状动脉损伤模型的建立及支架植入小型猪以安定5mg/kg和氯胺酮10mg/kg肌肉注射行基础麻醉，硫喷妥钠5mg/kg静滴维持。分离、穿刺股动脉，置入7F动脉鞘，行冠状动脉造影。选择左前降支，右冠状动脉的合适血管段，定量冠状动脉造影(QCA)测定其直径，于冠状动脉前降支和右冠冠状动脉分别植入不同支架。带支架球囊以球囊/血管1.3：1的比例，用10～15大气压、15s单次过度扩张血管形成冠状动脉损伤模型。每头小型猪分别被植入雷公藤甲素洗脱支架、裸金属支架或单涂层支架中的2枚。术后常规复查冠状动脉造影及冠状动脉内超声。术中应用肝素200U/kg。所有动物术前3天给予阿司匹林+抵克力得治疗直到实验结束普通饲料饲养。 (三)冠状动脉造影及冠状动脉内超声评价 1.在第5周重复冠状动脉造影，QCA测定最小管腔直径。使用ANCOR计算机心血管图像分析系统测定管腔狭窄直径。 2.同时重复冠状动脉内超声，评价支架内狭窄的发生情况。沿导丝送入血管内超声导管至支架上约1cm处，按2mm/s的速度匀速回拉，进行血管内超声检查并记录结果。采用血管内超声检查仪自带软件进行分析。 (四)定量评价支架血管段组织的内膜增生第5周处死小型猪、取出心脏，4％中性缓冲福尔马林70mmHg加压灌注固定20h后分离冠状动脉支架10mm内的血管段，生理盐水冲洗。 1.取材部位：剪取支架血管段的近、中和远端三个部分为病理组织标本。同时取近支架边缘5mm内的血管段。4％中性缓冲福尔马林固定。 2.切片及染色：带金属支架标本硬塑料包埋后，用骨科切片机切片，每段血管切2片，每支架共6片。不带支架的边缘血管段用石蜡包埋后普通切片机切片。所有切片用HE染色和Gieson弹力纤维染色制备光镜标本。 3.组织病理学检查：组织切片用微图像分析系统测定。用血管损伤积分标准(0分=内弹力膜完好，1分=内弹力膜撕裂，2分=内弹力膜和中膜撕裂，3分=外弹力膜撕裂)计算积分，取测定的平均值。测量支架段血管切片的管腔面积和冠脉横断面积，定量评价支架段血管组织内膜增生的程度。 (五)结论确定了详尽的实验计划，为雷公藤甲素药物洗脱支架在猪冠状动脉损伤后再狭窄的预防作用的研究的顺利实施创造了条件。 四、结论 1.观察了青蒿素、白藜芦醇及雷公藤甲素对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖、DNA合成及细胞周期的影响，证实了其对平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用。 2.成功地制备出了生物相容性好，药物释放持续稳定的雷公藤甲素药物洗脱支架。 3.确定了详尽的实验计划，为雷公藤甲素药物洗脱支架在猪冠状动脉损伤后再狭窄的预防作用的研究的顺利实施创造了条件。