研究背景肾细胞癌（Renalcellcarcinoma,RCC）是泌尿系统常见的肿瘤之一。2021年,美国估计有76080例新增病例,死亡13780例。肾透明细胞癌（Clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）是最常见的组织学亚型,约占所有病例的75%-80%。早期、局限性的ccRCC治愈率相对较高,患者5年生存率超过90%,一旦进展为远处转移性疾病,其5年生存率则降至12%。约有30%的患者在诊断时发现转移,剩余又有近30%的患者在随访期间发生转移,提示相对较差的预后。尽管近些年来,随着血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitor,TKI）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of rapamycin,mTOR）抑制剂等生物靶向治疗的应用,提高了疾病无进展生存期（Progression-freesurvival,PFS）,但同时也导致了肿瘤耐药以及转移和复发。随后,新兴的免疫检查点抑制剂单独或联合抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4（Cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA4）和抗程序性死亡受体1（Programmed death 1,PD-1）的使用丰富了治疗上的选择,但也带来了长期反应率较低的问题。因此,鉴别和验证新的肿瘤生物标记物,深入发掘ccRCC增殖和转移的分子机制,就显得极为迫切和有意义。越来越多的研究证实,ccRCC从根本上是一种代谢相关性疾病。众所周知,癌细胞即使在常氧条件下也主要通过乳酸发酵产生能量,而不是通过糖酵解后线粒体三羧酸（Tricarboxylicacid,TCA）循环产能,即经典的Warburg效应。这种包括TCA循环减少以及 VHL/HIF缺氧诱导因子（Von Hippel-Lindau/hypoxia inducible factor）突变通路上调在内的生物学过程,增加了癌细胞内脂肪酸合成以及胆固醇相关基因的表达,由此产生大量供给癌细胞营养的原料,这构成了 ccRCC细胞中脂质代谢重编程的基础。透明细胞癌在组织学上的定义源于大量甘油三酯和胆固醇酯等中性脂质在ccRCC中的积累,这种细胞中的脂质堆积是其基本病理特征。ccRCC尤其显现出脂质沉积而非脂质分解代谢的倾向,研究表明,其增殖和转移与脂肪酸合成、氧化分解代谢、胆固醇摄取和转运密切相关。ccRCC中大量的脂质储存具有两大功能:影响能量稳态以及在增殖过程中释放脂类用于细胞生物膜的合成。此外,脂质的堆积在细胞信号转导和活性、促炎性反应、表型转换以及药物治疗抵抗中也发挥着重要作用。因此,靶向脂质堆积将为揭示肿瘤的复杂机制提供新的治疗方向。鉴于此,我们利用TCGA（The Cancer Genome Atlas）公共数据库于脂质储存相关基因中构建了一个ccRCC患者预后相关风险模型,通过对预后模型的验证及多参数分析,筛选并提取出 AUP1（lipid droplet regulating very low-density lipoprotein assembly factor）,一个脂滴调节极低密度脂蛋白装配因子,其在ccRCC组织中显著高表达且与临床预后密切相关。进一步结合RNA-seq、体内、体外实验,我们发现AUP1通过同时介导脂肪酸和胆固醇代谢诱导ccRCC中的脂质堆积,实现脂质代谢重编程,从而促进ccRCC的进展。对其生物学功能及潜在分子机制的探究,有助于更好的理解ccRCC细胞脂质代谢的生物学过程,AUP1可作为治疗ccRCC一个新的有效潜在靶点和预后标记物。研究目的1.通过构建ccRCC患者的临床预后相关模型,分析预后相关风险因素,筛选并挖掘潜在的预后相关风险基因。2.明确AUP1在ccRCC中的表达水平及其调控肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭的生物学功能。3.探究AUP1介导细胞周期、凋亡调控细胞增殖并诱导EMT影响肿瘤侵袭、转移的作用机制。4.探究AUP1通过多种不同方式调节脂代谢并诱导脂质堆积的分子机制,从而为ccRCC的诊治及预后提供新的作用靶点。研究方法第一部分临床预后模型的构建及AUP1在肾透明细胞癌中的生物学作用1.构建预后相关风险模型:于TCGA数据库下载539例ccRCC患者组织和72例正常肾组织的mRNA序列表达数据,于GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）网站获取79个脂质储存相关基因。运用R语言及相关软件包进行多参数分析及预后风险模型的构建,生存曲线及ROC（Receiveroperating characteristic）曲线分析验证模型有效性,结合临床病理参数、风险评分、单/多变量COX回归分析、共表达分析绘制列线图,预测患者5年、7年、10年生存率。2.筛选目标基因:根据相关指数在模型中选取ccRCC组织中高表达且预后差的风险基因,结合基因功能属性及PubMed文献检索无相关报道,最终提取出AUP1作为目标基因进行后续实验验证及机制研究。3.收集临床组织标本,通过qRT-PCR及免疫组织化学染色评估AUP1在ccRCC及正常组织中mRNA及蛋白水平的表达。4.体外细胞系筛选及稳转株构建:通过Western Blot检测AUP1在各肾癌细胞株ACHN、A498、786-O、Caki-1以及正常肾小管上皮细胞HK-2中的表达,选取ACHN、A498进行慢病毒敲减AUP1细胞稳转株的构建,经qRT-PCR及Western Blot验证转染效率。5.体外功能实验:细胞敲低AUP1的表达水平后,通过CCK-8、EdU细胞增殖实验检测细胞增殖水平的变化,克隆形成实验检测细胞集落形成能力,划痕实验检测细胞的迁移水平,Transwell实验评估细胞的迁移和侵袭能力。第二部分AUP1调节脂代谢诱导脂质堆积在肾透明细胞癌中的分子机制研究1.通过RNA-seq技术检测AUP1敲低后与对照组之间mRNA水平表达差异,分析其潜在的生物学机制。2.通过油红O实验、甘油三酯试剂盒以及胆固醇试剂盒分别检测细胞内脂质水平的变化。3.通过Western Blot检测细胞周期、凋亡、上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白的变化。4.结合RNA-seq及脂质多通路韦恩图会聚分析,提取下游靶标SOAT1并经qRT-PCR及Western Blot验证;收集临床组织标本,通过qRT-PCR、免疫组化及Western Blot检测SOAT1在组织标本及体外细胞株中mRNA及蛋白水平的表达。5.细胞株转染小干扰RNA以敲低SOAT1,并经qRT-PCR及Western Blot验证敲低效率,通过CCK-8实验检测细胞增殖变化,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。6.挽救实验:在慢病毒敲减AUP1的细胞稳转株基础上及对照细胞中,继续转染质粒以过表达SOAT1,通过qRT-PCR及Western Blot验证转染效率,后通过CCK-8实验评估各对应细胞中增殖水平的变化,通过甘油三脂试剂盒、胆固醇试剂盒检测相对应细胞中脂质水平的变化。7.针对AUP1下游脂代谢相关蛋白行qRT-PCR测定及引物筛选,后通过Western Blot检测下游关键脂代谢相关蛋白的变化,结合TCGA数据库分析,Western Blot检测其在肾癌细胞株ACHN、A498及正常肾小管上皮细胞HK-2中的表达差异。8.运用组织芯片技术及免疫组织化学染色评估AUP1在ccRCC及癌旁正常组织中的表达。第三部分AUP1的抑制对肾透明细胞癌体内移植瘤模型的影响1.构建BALB/c裸鼠移植瘤模型,分为两组:慢病毒敲低AUP1组,阴性病毒对照组。2.实时监测裸鼠皮下移植瘤体积、体重变化,种瘤后饲养第28天处死裸鼠,移植瘤称重、拍照。3.制作移植瘤组织切片,行HE（Hematoxylin-eosin）染色及免疫组织化学染色检测相关蛋白水平变化。研究结果第一部分临床预后模型的构建及AUP1在肾透明细胞癌中的生物学作用1.79个脂质储存相关基因中69个在ccRCC和正常肾组织之间差异表达,包括39个上调和30个下调基因。单因素COX回归分析显示39个与预后相关基因,包括14个风险基因。经LASSO回归分析筛选出17个基因进行模型的构建,根据中位风险评分分成高风险、低风险组,生存曲线分析证实高风险组生存率较低,ROC曲线分析表明模型可准确预测ccRCC患者的生存率。进一步结合临床病理参数通过多变量COX回归分析显示,风险评分、年龄、肿瘤分期、分级是患者预后的独立危险因素,基于上述变量绘制的列线图可准确预测患者5年、7年及10年生存率。6个基因在模型中高表达（logFC＞0）且预后差（Hazard ratio,HR＞1）,进一步结合预后分析相关指数、文献检索及基因功能属性,提取出AUP1作为目标基因。2.AUP1在ccRCC组织中的mRNA和蛋白表达水平显著高于癌旁正常组织,且与病理分级密切相关,与TCGA数据库结果相一致。AUP1在肾癌细胞株ACHN、A498中的表达量显著高于正常肾小管上皮细胞HK-2。3.慢病毒构建的稳转株,与对照组相比,可有效降低ACHN、A498细胞中AUP1的mRNA和蛋白水平。4.AUP1的表达降低,抑制了ccRCC细胞的增殖和集落形成,削弱了细胞的迁移和侵袭能力。第二部分AUP1调节脂代谢诱导脂质堆积在肾透明细胞癌中的分子机制研究1.RNA-seq共发现1964个差异表达基因,其中558个下调,1406个上调。GO（Gene Ontology）功能富集分析显示AUP1下游差异表达信号分子涉及的主要生物学过程是:细胞对脂肪酸反应、脂肪酸反应、DNA复制、涉及细胞周期有丝分裂G1/S期转换的转录调控、胆固醇外流、上皮细胞分化/增殖的调控、脂质定位和脂质转运。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路数据库和Reactome通路数据库富集分析显示涉及的主要通路是细胞周期（尤其G1/S期转换）和DNA复制。2.AUP1在ccRCC中同时介导脂肪酸和胆固醇代谢。油红O实验、细胞内甘油三酯及胆固醇测定慢病毒敲低AUP1后,细胞内甘油三脂及胆固醇含量均下降。3.AUP1通过调控细胞周期、抑制凋亡促进肾癌细胞增殖,通过调控EMT促进肾癌细胞迁移和侵袭。Western Blot测定AUP1敲低后,细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin-dependent kinase 8、cell division cycle 6的表达均降低。促凋亡蛋白Bax、凋亡执行蛋白cleaved caspase-3表达升高,抗凋亡蛋白Bc12表达下调。E-cadherin表达上调,N-cadherin、vimentin和MMP9的表达均下调。4.脂质多通路韦恩图会聚分析及q-PCR、Western Blot证实,伴随AUP1的表达降低,SOAT1的表达水平显著降低。相较于癌旁正常组织及正常肾小管上皮细胞HK-2,SOAT1在ccRCC组织及ACHN、A498细胞株中的mRNA和蛋白表达水平显著增加,且随着肿瘤病理分级的进展,其蛋白表达量逐级上升。小干扰RNA可有效降低ACHN、A498细胞中SOAT1的mRNA和蛋白水平。抑制SOAT1的表达,可降低ccRCC细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力。5.AUP1通过靶向SOAT1诱导脂质堆积以部分促进ccRCC进展,脂质含量的增加挽救了细胞死亡并促进了细胞增殖。转染质粒效率经q-PCR及Western Blot检测,ACHN和A498细胞株中SOAT1的mRNA和蛋白水平显著过表达。CCK-8细胞增殖实验及细胞内甘油三酯、胆固醇含量测定显示,过表达SOAT1增强了ccRCC细胞的增殖,增加了ACHN、A498细胞中甘油三酯及胆固醇含量。同时,上调SOAT1可以部分逆转由于AUP1敲低对细胞增殖的抑制以及细胞内甘油三酯和胆固醇水平的下降。6.AUP1通过促进脂肪酸从头合成、抑制脂肪酸β氧化和脂质转运、调节脂质分解诱导ccRCC细胞的脂质堆积,实现脂质代谢重编程,但不通过影响细胞内胆固醇合成通路。q-PCR测定RNA-seq中脂代谢相关基因,抑制脂肪酸生成的关键酶PRKAA2和脂质转运蛋白STARD5在AUP1敲低后显著上调。Western Blot证实PRKAA2、STARD5以及脂肪酸β氧化关键酶CPT1A,伴随AUP1敲低其蛋白表达水平显著增加,而脂解关键酶MGLL蛋白水平显著降低,同时胆固醇合成的关键酶HMGCR无显著变化。7.结合TCGA数据库分析,通过Western Blot发现,相较于正常肾小管上皮细胞HK-2,在肾癌细胞株ACHN、A498细胞中,MGLL表达显著增高,STARD5、PRKAA2、CPT1A的表达显著降低,MGLL和STARD5可作为ccRCC潜在的生物标记物。8.组织芯片技术进一步证实,相较于癌旁正常组织,ccRCC组织中的AUP1表达量显著增加。第三部分AUP1的抑制对肾透明细胞癌体内移植瘤模型的影响1.AUP1的抑制对体内移植瘤生长的影响。相比对照组,敲低AUP1显著削弱了裸鼠移植瘤的生长速度,移植瘤的体积、重量显著降低。2.鉴于AUP1脂质储存及调节脂代谢的功能,抑制AUP1的表达后,裸鼠体重在整体上无显著变化。3.脂代谢调控对裸鼠移植瘤的影响。HE及免疫组织化学染色检测AUP1及其下游SOAT1的表达量。相比对照组,伴随移植瘤的生长速度被抑制,AUP1和SOAT1的表达水平均降低,表明脂代谢调控的降低抑制了体内移植瘤的增殖。结论1.AUP1在ccRCC组织中的表达显著高于正常组织,且与分期、分级密切相关,降低AUP1的表达可抑制ccRCC细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭水平。2.AUP1同时介导ccRCC细胞的脂肪酸和胆固醇代谢,并通过调控细胞周期、抑制凋亡促进ccRCC细胞增殖,通过调控EMT促进ccRCC细胞迁移和侵袭。3.AUP1通过靶向SOAT1诱导脂质堆积以部分促进ccRCC的进展。4.AUP1通过促进脂肪酸的从头合成、抑制脂肪酸β氧化和脂质转运、调控脂解实现脂质代谢重编程,从而促进ccRCC的发生发展,但不依赖于内源性胆固醇的合成通路。