论文部分内容阅读
第一部分牙龈卟啉单胞菌诱导人绒毛外滋养层衍生细胞HTR-8/SVneo分泌炎性因子和凋亡目的:早产是新生儿发病和死亡的一个主要原因。大量研究表明牙周炎和早产之间存在联系。本部分实验的目的是探讨牙周炎主要致病菌牙龈卟啉单胞菌与人绒毛外滋养层衍生细胞HTR-8/SVneo之间的相互作用。方法:通过ELISA检测HTR-8/SVneo细胞分泌的炎性因子。用Annexin V/PI流式细胞术评估细胞凋亡。用Western blot检测蛋白表达。结果:牙龈卟啉单胞菌能够入侵HTR-8/SVneo细胞并且在胞内存活。当HTR-8/SVneo细胞被牙龈卟啉单胞菌感染时,细胞释放大量IL-8和IFN-γ。IL-8水平在感染6小时后开始升高,感染24小时后达到峰值,感染48小时后降低;IFN-γ水平在感染24小时后开始升高,在感染48小时后达到峰值。同时,牙龈卟啉单胞菌导致HTR-8/SVneo细胞早、晚期凋亡以及active caspase-3蛋白表达显著增加。此外,加热灭活的牙龈卟啉单胞菌和牙龈卟啉单胞菌脂多糖均能诱导HTR-8/SVneo细胞分泌IL-8,而牙龈卟啉单胞菌条件培养基能诱导细胞分泌IL-8和凋亡。结论:牙龈卟啉单胞菌能够入侵HTR-8/SVneo细胞并且诱导细胞分泌炎性因子和凋亡。牙龈卟啉单胞菌感染对人滋养层细胞炎性因子和凋亡的异常调节将使临床医师对牙周炎和牙周炎致病菌影响孕妇早产的机制有更加深入的理解。第二部分MAPK和NF-κ B信号通路在牙龈卟啉单胞菌诱导HTR-8/SVneo细胞分泌炎性因子和凋亡中的作用目的:探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核转录因子-κB(NF-κB)信号通路是否参与调控牙龈卟啉单胞菌诱导的HTR-8/SVneo细胞炎性因子分泌和凋亡。方法:通过ELISA检测HTR-8/SVneo细胞分泌的炎性因子。用AnnexinV/PI流式细胞术评估细胞凋亡。用Western blot检测蛋白表达。用特异性药理抑制剂失活相关信号通路(p38 MAPK,SB203580;ERK1/2,U0126;JNK,SP600125;NF-κB,JSH-23)来确定它们在炎症和凋亡中的作用。结果:在存在牙龈卟啉单胞菌感染的条件下,每种抑制剂至少显著抑制了一种由HTR-8/SVneo细胞释放的炎性因子。对炎性因子释放最有效的抑制剂是SB203580和U0126,其次为SP600125和JSH-23。值得注意的是,通过失活单一信号通路均不能完全阻断牙龈卟琳单胞菌诱导的炎性反应,提示牙龈卟啉单胞菌诱导HTR-8/SVneo细胞分泌IL-8和IFN-γ可能同时涉及到多条信号通路。此外,SP600125和JSH-23对牙龈卟啉单胞菌感染所导致的细胞凋亡没有显著影响。然而,抑制剂U0126和SB203580均部分但显著地抑制了牙龈卟啉单胞菌诱导的细胞凋亡,U0126的抑制作用较大。结论:本部分实验表明,ERK1/2和p38 MAPK信号通路的活化参与了牙龈卟啉单胞菌诱导的HTR-8/SVneo细胞炎性因子分泌和凋亡。第三部分IFN-γ分泌和Fas表达参与了牙龈卟啉单胞菌诱导的HTR-8/SVneo细胞凋亡目的:1)探讨炎症(IFN-γ)在牙龈卟啉单胞菌诱导的HTR-8/SVneo细胞凋亡中的作用;2)探讨Fas/FasL通路在牙龈卟啉单胞菌诱导的细胞凋亡中的作用及其与ERK1/2信号通路的关系。方法:用Annexin V/PI流式细胞术评估HTR-8/SVneo细胞凋亡。用CCK-8试剂盒评估细胞活性。用Western blot检测蛋白表达。通过ELISA检测细胞分泌IFN-γ的水平。结果:牙龈卟啉单胞菌感染显著增加了 HTR-8/SVneo细胞凋亡和Fas的蛋白表达,并且细胞凋亡的增加表现为细胞活性的降低。ERK1/2信号通路抑制剂U0126和阻断FasL/Fas相互作用的FasL中和抗体NOK1都显著抑制了牙龈卟啉单胞菌导致的细胞活性降低。重组IFN-γ也显著降低了活性HTR-8/SVneo细胞的比例,增加了 Fas的蛋白表达,并且NOK1能够显著抑制IFN-γ诱导的细胞活性降低,表明IFN-γ可能在牙龈卟啉单胞菌诱导的HTR-8/SVneo细胞凋亡中发挥着重要作用,至少部分是通过调节Fas的表达而实现。此外,U0126同时使IFN-γ分泌和Fas表达降低,接近于对照水平。结论:牙龈卟啉单胞菌通过ERK1/2信号通路诱导HTR-8/SVneo细胞分泌IFN-γ和表达Fas,同时IFN-γ和Fas均参与了牙龈卟啉单胞菌诱导的细胞凋亡,并且IFN-y对凋亡的作用至少部分是通过调节Fas的表达而实现。