水稻氮代谢相关基因OsARG的克隆与功能分析

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水稻是我国最重要的粮食作物之一,其产量的提高对确保我国农业可持续发展具有重要的战略意义。氮素是植物生长发育的主要营养元素,适当增加氮肥的施用量是水稻获得高产的重要措施,但是氮肥的过量施用也造成了作物种植效益降低和环境污染等负面影响。因此,研究如何提高作物的氮素利用效率对农业的可持续发展具有重要的意义。本研究利用一个水稻氮营养缺陷型突变体,通过图位克隆的方法分离了水稻中与氮代谢相关的一个重要基因,并进行了功能分析,为阐明水稻高效吸收利用氮素的遗传机理,从分子生物学途径改良作物的氮素利用率提供了重要的分子基础。本文主要研究结果如下:1.水稻突变体abp1来源于四倍体间杂种H3774的花药培养后代,是经过多代自交形成的稳定株系。主要特征是株高偏矮、穗长降低、穗上部坏死、干尖、籽粒窄细、千粒重低,最明显的差异是结实率低,只有10.26%,而野生型的结实率高达92.82%。虽然突变体的颖花发育正常,但花粉育性降低。氮肥梯度实验表明,突变体对外源氮素较敏感,随着氮肥施用量的增加,突变表型得到部分恢复。在相同的氮素供应条件下,突变体茎叶等营养器官中的氮含量与野生型相比增加显著,说明氮素向贮藏器官籽粒转运的效率比较低,是一个氮营养缺陷型突变体。2.之前的研究已经将水稻abp1突变基因定位在第4染色体的标记In10和AL1-1之间,物理距离为76Kb,含有13个完整的开放阅读框。测序比较发现,在ORF8的编码区有一个单碱基的突变,形成终止密码子(TGA),造成蛋白翻译的提前终止,因此将该基因确定为候选基因。将ORF8的全长cDNA和包含自身启动子的基因组片段分别转入突变体中,其转基因植株的表型得到恢复。另外,我们还分析了一个ORF8的T-DNA插入突变体abp1-2,它与abp1表型完全一致,表明ORF8就是目标基因,将其命名为OsARG。3.OsARG编码精氨酸酶,在水稻基因组中只有1个拷贝。定量RT-PCR和GUS组织染色的分析结果表明,该基因在水稻的根、茎、叶、叶鞘和穗中都有表达。突变体abp1中OsARG的表达水平与野生型相比显著降低,OsARG碱基突变还影响了氮代谢途径中的基因OsGS1;1的表达,与野生型相比,该基因的表达水平增加显著。亚细胞定位的结果初步表明,OsARG蛋白在水稻原生质体中呈点状分布,符合用软件分析得出的OsARG蛋白N端有一个线粒体定位序列的推测。4.在突变体abp1中,OsARG基因编码区的单碱基突变使得该蛋白翻译提前终止,造成了突变体中精氨酸酶的催化活性丧失,其作用底物精氨酸的含量过量累积,使abp1中氮素循环出现异常,从而导致了突变体株高偏矮、穗长缩短、穗上部坏死、籽粒窄细、结实率和千粒重降低等不良表型。5.在过表达OsARG的转基因植株中,单株产量、单株实粒数和结实率与对照相比都增加显著,而且产量的增加主要归因于单株实粒数的增加,表明利用OsARG基因的过量表达可以调控和改善植株体内的氮素代谢,提高水稻的氮素利用效率,实现增加产量的可能性。
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