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甘蓝型油菜(Brassica napus L.)含油量范围在27.4%-52.7%,是我国重要的油料作物。高含量的脂质更易在贮藏期间发生过氧化,导致种子活力的快速衰退。本研究以甘蓝型油菜品种“浙油18”为实验材料,采用高温老化处理,获得不同活力水平(发芽率99%、80%、49%、5%)的种子材料,测定种子内氧化还原状态,采用UPLC-QTOF-MS/MS方法分析老化过程中种子脂质构成变化,分析磷脂代谢关键基因表达模式变化,观测细胞膜超微结构和完整性变化,明确老化处理对油菜种子脂质影响,以期进一步完善种子老化机理。主要研究结果如下:(1)人工老化影响了油菜种子脂质组成。老化处理对油菜种子总脂质的影响很小,主要体现在甘油酯含量小幅增加,而磷脂含量快速减少。与对照(99%)相比,在发芽率80%、49%和5%的种子中磷脂相对含量分别减少了9.11%、25.95%以及27.76%,二酰甘油(DG)相对含量则分别上升了3.28%、5.37%、9.31%。此外,种子中脂肪酸含量也随着老化程度的加深而逐渐降低。(2)人工老化影响了油菜种子磷脂的构成。与对照相比,人工老化油菜种子中磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷脂酰丝氨酸(PS)的相对含量显著降低,而磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰甘油(PG)的含量则逐渐积累。其中PC是含量最丰富的磷脂,对照种子中相对含量为3.84%,而发芽率5%种子中相对含量则降低至2.75%,相比对照下降了接近30%。虽然PC总体趋势是随着老化加剧而持续降低,但个别PC,例如PC(46)则呈增加趋势,表明人工老化处理对不同碳链长度的磷脂的影响存在差异。磷脂的不饱和指数随着老化而呈现逐渐降低的趋势,其中PA、PC、PE以及PG不饱和度最高的磷脂下降幅度最大。PC等膜脂的含量降低暗示人工老化可能会对细胞膜系统中磷脂的构成产生不利影响,而磷脂不饱和程度的下降则可能与脂质过氧化相关。(3)人工老化影响磷脂代谢关键基因的特异性表达。在老化过程中,磷脂酶如磷脂酶C(PLC)和磷脂酸磷酸酯酶(PAP)高表达催化磷脂降解生成DG;而磷脂酶D(PLD)催化PC和PE降解生成PA,其基因表达仅略有上调。乙醇胺/胆碱磷酸转移酶(CEPT)催化DG合成PE和PC,在老化过程中CEPT基因上调表达。结合磷脂含量变化表明种子磷脂代谢不同关键基因对人工老化的响应不一致,导致基因协调表达失衡。(4)ROS过量积累和脂质过氧化可能是种子活力丧失的原因之一。DAB染色发现老化种胚的H2O2呈现逐渐增加的趋势。随着老化程度的加深,GSH最终降低了69.8%,EGSSG/2GSH则从-184.97m V上升至-166.06m V,细胞内环境趋向氧化状态。而且与对照相比,低活力种子脂质过氧化终产物—MDA的含量增加了将近50%。说明ROS过量积累导致细胞氧化还原状态失衡,造成细胞膜脂过氧化,后者会导致膜脂的不饱和度降低,影响膜系统的稳定性与流动性,进而引起种子活力丧失。(5)人工老化引起质膜结构损伤。膜荧光标记FM4-64结果显示,对照种子质膜染色均匀,胞内基本无染色,表明对照种子质膜结构完整;而随着种子老化加剧,观察到胞内荧光强度逐渐增强;利用电镜在老化种子细胞中观察到细胞膜不连续现象;此外,种子浸出液的电导率也显著增加,说明老化破坏了细胞膜的完整性和通透性,导致大量内含物质外渗。(6)筛选获得一批可作为种子活力丧失预警指标的脂质。通过建立OPLS-DA模型,筛选出与种子活力密切相关的9个差异脂质,包括磷脂类6种(主要为PC)、甘油酯1种和脂肪酰类2种等,为今后进一步研发种子活力丧失预警技术奠定了基础。综上所述,人工老化造成甘蓝型油菜“浙油18”种子中ROS过量积累,导致细胞氧化还原状态失衡,膜脂发生过氧化,影响磷脂基因的表达,降低磷脂含量,加剧细胞膜的损伤,破坏细胞膜的通透性与稳定性,最终造成膜系统功能紊乱,导致种子活力降低。