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老年性痴呆即阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),是一种常见的神经系统退行性疾病,是痴呆最常见的类型。随着世界人口的老龄化及人们生活方式的改变,AD的患病率越来越高,带来沉重的社会经济负担,AD的防治,已成为急待研究和解决的课题。中医学在痴呆的治疗方面有丰富的理论和许多有效方药,对临床效果明显的中药进行进一步的研究开发意义重大且有科学前景。石菖蒲是治疗痴呆最常用的中药之一,相关研究已从多种在体和体外模型验证了石菖蒲及其主要的活性成分B-细辛醚、丁香酚对AD的治疗作用,并初步探讨了其作用机理,但目前研究所采用的模型仅是模拟AD的主要症状—学习记忆障碍。APPswe/PS1dE9小鼠可表达突变的人类早老素(DeltaE9)和人鼠淀粉样蛋白前体蛋白(APPswe)融合体,该小鼠脑内淀粉样斑块从4月龄开始出现并随增龄而增加。在以B淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)为基础的病理机制的研究以及AD治疗药物的开发等领域中具有重要应用价值。研究石菖蒲活性成分p-细辛醚、丁香酚对APPswe/PS1dE9小鼠学习记忆和Aβ的影响对于进一步证实其药效有重要价值。Aβ发生错误折叠、聚集并沉积于老年斑是AD的主要病理标志,而分子伴侣可调控蛋白质折叠,保护细胞免于蛋白质错误折叠和聚集所致的毒性损害。Clusterin,也称载脂蛋白J(apolipoprotein J),是一种多功能的伴侣分子,能结合和稳定Aβ并通过低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(Low-density lipoprotein receptor-related protein-1, LRP-1)及LRP-2/megalin介导Aβ内吞进入胶质细胞或通过血脑屏障清除；此外,还能掩蔽Aβ纤维使其免于宿主免疫防御的识别而阻止过度的炎症反应；通过TGFβ信号通路促进神经细胞存活,阻止Bax依赖的神经变性凋亡,等等。研究β-细辛醚、丁香酚对Clusterin神经保护途径的调控作用有益于进一步揭示其作用机制。目的研究石菖蒲活性成分β-细辛醚、丁香酚对APPswe/PS1dE9小鼠学习记忆和Aβ的影响以及对Clusterin神经保护途径的调控作用。证实β-细辛醚、丁香酚治疗AD的疗效并深入探讨其作用机制。3月龄SPF级雄性APPswe/PS1dE9双转基因小鼠42只,随机分为模型组、β-细辛醚治疗组、丁香酚治疗组、盐酸多奈哌齐(安理申)阳性药物对照组,每组13只。使用同龄同背景APPswe/PS1dE9转基因阴性鼠13只作为正常对照。β-细辛醚和丁香酚的给药剂量均为21.2mg/kg/d,安理申给药剂量为2mg/kg/d,模型组和转基因阴性对照组以蒸馏水灌胃,每日1次,给药共4个月。给药结束后,采用Morris水迷宫法检测空间学习记忆能力；采用刚果红染色法检测小鼠皮质和海马淀粉样斑块；采用Dot blot法检测脑组织Aβ寡聚体的表达,并采用两变量相关分析Aβ寡聚体表达与学习记忆成绩的关联性；采用Western blot法检测小鼠脑组织Clusterin的表达;采用免疫组织化学荧光双标染色法检测小鼠皮质及海马Clusterin与Aβ寡聚体的共定位及相互作用；采用免疫组织化学染色法检测小鼠皮质及海马LRP-1及LRP-2/megalin的表达。实验一：石菖蒲活性成分对APP/PS双转基因小鼠学习记忆的影响与正常组比较：模型组定位航行第3-5天的逃避潜伏期均明显延长(P<0.01),第4-5天游泳路程明显增加(第4天,P<0.05；第5天P<0.01),穿越平台次数明显减少(P<0.01)；与模型组比较：B细辛醚组第5天的逃避潜伏期明显缩短(P<0.05),第5天游泳路程明显缩短(P<0.05)；丁香酚组在逃避潜伏期及游泳路程方面无显著变化,但有缩短的趋势；安理申组第5天游泳路程明显缩短(P<0.05)。实验二：石菖蒲活性成分对APP/PS双转基因小鼠脑内B淀粉样蛋白的影响(1)正常组小鼠海马及皮质均未见淀粉样斑块。APP/PS双转基因小鼠皮质、海马各部散见淀粉样斑块。与模型组相比较：B细辛醚组海马淀粉样斑块明显减少(P<0.05)；丁香酚组海马淀粉样斑块面积百分比显示出减少的趋势；安理申组海马及皮质的淀粉样斑块面积百分比均无明显变化(P>0.05)(2)Aβ寡聚体的表达与水迷宫逃避潜伏期存在一定的正相关关系(Pearson相关系数=0.343,P<0.05),Aβ寡聚体的表达越强,小鼠的水迷宫逃避潜伏期越长,学习记忆能力越差。小鼠脑组织Aβ寡聚体表达水平组间差异无统计学意义(P>0.05)。但从趋势来看,模型组Aβ寡聚体蛋白表达水平较正常组增高,而B细辛醚组、丁香酚组、安理申组Aβ寡聚体蛋白表达水平较模型组均有所下降。实验三：石菖蒲活性成分对APP/PS双转基因小鼠Clusterin神经保护途径的影响(1) APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马及皮质广泛存在Clusterin与Aβ寡聚体的共表达,提示二者存在相互作用。小鼠脑组织Clusterin表达水平组间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)正常组海马CA1区及皮质可见较多LRP-1染色阳性区域,以微血管的表达为主。模型组小鼠海马CA1区及皮质LRP-1表达均较正常组明显减少(P<0.05)。与模型组比较：β细辛醚组海马CA1区及皮质LRP-1表达均明显增加(P<0.01)；丁香酚组皮质LRP-1表达明显增加(P<0.01),海马CA1区LRP-1表达有较模型组增加的趋势；阳性对照药物安理申海马CA1区及皮质LRP-1表达有增加的趋势,但差异均无统计学意义。(3)正常组即转基因阴性小鼠海马CA1区及皮质可见较多LRP-2/megalin表达；模型组即APPswe/PS1dE9双转基因小鼠皮质LRP-2/megalin表达较正常组明显减少(P<0.01),海马CA1区LRP-2/megalin表达较正常组也有减少的趋势；与模型组相比：β细辛醚组皮质及海马LRP-2/megalin表达无明显变化;丁香酚组皮质LRP-2/megalin表达明显增加(P<0.01),海马CA1区LRP-2/megalin表达也有增加趋势；阳性对照药物安理申组海马CA1区及皮质LRP-2/megalin表达无显著变化,海马CA1区LRP-2/megalin表达较模型组有增加的趋势。(1)β细辛醚可有效改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的学习记忆能力,减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马淀粉样斑块,上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织LRP-1的表达。(2)丁香酚可明显上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织LRP-1及LRP-2/megalin表达水平。(3)Aβ寡聚体与学习记忆能力呈负相关。APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Clusterin与Aβ寡聚体存在相互作用。(4)β细辛醚对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织Aβ寡聚体、Clusterin表达的干预作用,丁香酚对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠学习记忆、淀粉样斑块、Aβ寡聚体、Clusterin表达的影响需要进一步研究证实。