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肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一种重要的炎症因子,主要由激活的单核/巨噬细胞产生。TNF-α在机体的免疫应答与炎症反应中起着重要作用,控制着细胞分化、增殖与凋亡。它以两种形式存在:26kDa的膜型TNF-α(mTNF-α)与17kDa的可溶型TNF-α(sTNF-α),sTNF-α由mTNF-α酶解而来。两型TNF-α通过与两型受体(TNFR1与TNFR2)结合而发挥广泛的生物学作用,但两型TNF-α的胞毒作用方式和机制不尽相同。此外,mTNF-α除了作为配体与TNFR结合后向靶细胞传递正向信号而发挥生物学效应外,还可同时作为受体向效应细胞传递反向信号(reverse signaling)。本室前期工作已经建立了能分泌含三种TNF-α基因(野生型TNF-α、膜型TNF-α突变体和分泌型TNF-α突变体)的重组逆转录病毒的包装细胞。本研究首先培养这三株包装细胞,分别收集高滴度逆转录病毒,感染自身TNF-α表达量极低的人骨肉瘤细胞系(MG63),用G418筛选两轮得到稳定表达wTNF-α、mTNF-α和sTNF-α蛋白的细胞模型,为进一步研究两型TNF-α的生物学功能以及信号转导通路等提供实验工具。一、鉴定MG63细胞TNF-α的表达同等条件下分别提取MG63细胞和HL-60细胞的总mRNA进行RT-PCR检测,经过35个循环后,取相同量的产物进行电泳,结果证实:MG63细胞中TNF-αmRNA水平极低,明显低于HL-60细胞。同时,在相同条件下分别提取MG63细胞和HL-60细胞的总蛋白进行Western blotting检测,结果显示HL-60细胞可见明显的TNF-α条带,MG63细胞仅出现一条微弱的条带,而两者的β-actin蛋白量一致,提示MG63细胞的TNF-α表达量很低。此外,流式细胞术检测结果显示:MG63细胞的TNF-α表达量为0.53%;ELISA检测其培养上清中表达的sTNF-α低于检测水平。二、稳定表达TNF-α及其突变体细胞模型的建立复苏本室前期工作建立的表达TNF-α及其突变体基因的重组逆转录病毒的包装细胞克隆,收集高滴度逆转录病毒,感染MG63细胞,经过筛选建立了表达TNF-α及其突变体基因的三种细胞模型。用各种方法鉴定证实TNF-α及其突变体基因在MG63细胞中得到有效表达。FCM结果显示:MG63/wTNF细胞表达TNF-α量达29.97%;MG63/mTNF细胞表达TNF-α的量高达70.84%;然而MG63/sTNF细胞表面也有少量的TNF-α的表达(9.15%),可能是由于细胞表面的TNFR结合了部分培养上清中的sTNF-α所致。ELISA检测证实MG63/wTNF细胞和MG63/sTNF细胞的培养上清中sTNF-α的含量很高,分别为437.16pg/ml、380.95pg/ml;而MG63/mTNF细胞的培养上清中sTNF-α的表达量低于检测水平。免疫荧光结果显示MG63/sTNF细胞表面有微弱的荧光,呈环状分布;而MG63/wTNF细胞和MG63/mTNF细胞可见有很强的绿色荧光。Western blotting检测的结果表明:MG63/wTNF细胞可见有26kD的mTNF-α和17kD的sTNF-α,但sTNF-α的量远远低于mTNF-α,仅见微弱的条带;MG63/mTNF细胞仅见明显的26kD的mTNF-α的表达;MG63/sTNF细胞仅见微弱的26kD mTNF-α,但其培养上清中可见有明显的17kD sTNF-α的表达。上述结果均提示这三种细胞模型建立成功。三、TNF-α及其突变体的生物活性采用TNF-α敏感细胞株L929鉴定TNF-α及其突变体的生物学活性。将三种细胞株培养至对数生长期,取相同细胞数培养24～48h,收集培养细胞和上清分别与靶细胞细胞共孵育,进行TNF-α胞毒活性的检测。结果显示:固定的MG63/mTNF细胞具有胞毒活性(64.28%);MG63/sTNF细胞的培养上清亦具有胞毒活性(30.65%);MG63/wTNF细胞的固定细胞和培养上清均有胞毒活性(37.79%、38.02%)。此外,细胞的胞毒效应与其TNF-α的表达量呈正相关,并且胞毒效应均能被TNF-α单抗所阻断(p<0.01),提示其胞毒活性为TNF-α特异性的。四、细胞表达TNF-α基因的持久性检测本研究的目的是建立稳定表达目的基因的细胞模型,故为了观察细胞表达目的基因的持久性,采用了FCM定期测定连续培养的细胞模型TNF-α表达量的改变。检测结果显示:在G418维持培养下,细胞株经过6次传代培养约4周左右,TNF-α的表达量从86.23%下降至50%左右;而无G418维持培养的细胞株,经过约5次传代培养约2.5周左右,TNF-α的表达量下降至50%。此外,由于细胞克隆在长时间传代培养后,目的基因的表达率明显下降。为了维持较高表达目的基因的细胞克隆,将复苏的细胞克隆(FCM检测其TNF-α的表达率为21.29%)再次进行亚克隆筛选,从而获得了目的基因表达较高的亚克隆,FCM检测其mTNF-α的表达率达到87.08%。结论:成功建立稳定表达野生型、跨膜型和分泌型TNF-α基因的人源细胞模型。三种细胞模型表达的TNF-α及其突变体基因均具有生物学活性。