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双孢蘑菇(Agaricus bisporus)为真菌门担子菌纲口蘑科口蘑属食用真菌,具有极高的食用和药用价值,然而褐化作为影响双孢蘑菇货架期的因素始终未能从根本上得到解决。近年来在双孢蘑菇全基因组测序完成后,功能基因组学提上日程,为了从本质上缓解双孢蘑菇的褐化问题,本实验首先对作为技术基础的高效的遗传转化体系进行研究,找到双孢蘑菇遗传转化的最优条件,为研究基因功能做好充分准备,接着对采摘后不同时间不同温度的子实体RNA进行转录组分析,并以转录组分析结果为理论依据,找到与双孢蘑菇褐化相关差异表达基因,对双孢蘑菇黑色素形成机理进行初步探索,为双孢蘑菇中其他功能基因的研究奠定基础。在本研究中,我们首先对影响双孢蘑菇菌丝农杆菌转化效率的主要条件农杆菌菌种、菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、菌丝培养时间以及浸染时间做了L16(4~5)的正交实验,通过对各因素影响的分析,得出对转化效率影响最大的因素为菌丝培养时间和农杆菌菌种,且当菌种为LBA4404、菌液浓度OD600=0.8、乙酰丁香酮浓度为100μmol/L、菌丝培养时间为40 d、浸染时间为10 min时,农杆菌介导的双孢蘑菇转化效率最高。其次,以采摘后双孢蘑菇子实体为材料,测序前通过灰度分析选取了与室温1、2、3天灰度系数最接近的4℃3、6、9天的样品,因此共提取RNA样品7份,分别为0天对照(0)、常温一天(C1)、常温两天(C2)、常温三天(C3)、4℃三天(S3)、4℃六天(S6)、4℃九天(S9)。接着通过RNA-seq技术进行测序,转录组测序共得到clean reads 1.05*10~9条,比对到全基因组的平均覆盖率达到59.12%。测序完成后分常温和4℃两组进行分析,均以0天样品作为对照,分别将每组中的其他三个样品与0天进行进行比较,常温组0-C1、0-C2、0-C3分别得到差异表达基因3569、3653、3657个,4℃组0-S3、0-S6、0-S9分别得到差异表达基因3388、3389、3805个。为了将温度和储存时间对褐化的影响区别开来,对两组中灰度系数相近0-C1与0-S3、0-C2与0-S6、0-C3与0-S9进行比较,分别得到通过储存时间影响双孢蘑菇褐化的基因2210、2386、2554个。并选出对双孢蘑菇褐化影响较大的5个基因家族,分别是C4H、GGT、PPO、MNP、PAL。最后从差异表达基因中挑选6个,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对转录组测序结果的有效性和准确性进行验证,验证实验结果显示q RT-PCR实验结果与转录组测序结果相一致,从而进一步佐证了转录组测序结果。本课题通过对农杆菌转化体系的优化获得了高效的转化条件,为后续研究提供了良好的技术基础并通过RNA-seq技术对不同温度下不同时间点的子实体进行了转录组分析,找到了褐化相关的差异表达基因,为进一步研究双孢蘑菇褐化相关基因的表达模式,揭示双孢蘑菇褐化过程中黑色素生成的分子机制提供理论数据支撑。