论文部分内容阅读
近年来,我国水禽的呼肠孤病毒感染不断发生,并逐渐呈流行趋势,严重影响了水禽业的健康发展。1997年我国番鸭出现以软脚、腹泻、肝白色坏死为主要特征的番鸭肝白点病,2005年出现以心：脾、肝、法氏囊等多器官出血／坏死为主要特征的鸭坏死性肝炎,证明其其病原均为禽呼肠孤病毒(Avianreo virus, ARV)。研究表明,禽呼肠孤病毒感染无论从流行病学、临床症状和病理变化,以及病毒生物学特性、基因组片段特征和序列同源性等方面均发生了变化。本实验室从太湖发病鸭厂的病鸭组织中分离了一株病毒,经证明其为新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV),将该病毒命名为新型鸭呼肠孤病毒太湖2011株(NDRV TH11)。σ C蛋白为禽呼肠孤病毒的吸附蛋白,能刺激机体产生特异性中和抗体,aC蛋白还能够与呼肠孤病毒竞争性的吸附细胞,吸附后可阻断病毒对细胞的吸附,所以以aC蛋白制备的基因工程苗具有良好的免疫保护性。本研究制备了NDRVσC蛋白的兔源多克隆抗体,构建重组杆状病毒BV-σC,并对表达的aC蛋白进行疫原性检测和动物试验。主要研究内容如下：1、NDRVσC蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备构建原核表达质粒pET30a-aC,将原核表达质粒pET30a-σC转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,IPTG诱导后获得的重组蛋白经SDS-PAGE, Western blot鉴定,结果获得大小约为34KD的重组蛋白,与预期结果相符,且表达的重组蛋白具生物学活性,以纯化的σC蛋白免疫实验兔制备了抗σC蛋白的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示其效价达1：20000以上；间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别NDRV的σC蛋白,显示出σC蛋白具有良好的免疫原性。2、NDRVaC蛋白在sf9细胞中的表达及鉴定将NDRVaC基因插入杆状病毒载体pFastBacTM,经过同源重组,蓝白斑筛选,获得重组穿梭杆粒Bacmid-σC,转染sf9细胞,同时转染空Bacmid作对照,获得的重组杆毒通过噬斑实验测定的病毒滴度为2×107pfu/ml.通过SDS-PAGE,证明成功表达了σC蛋白,Western-blot、IFA结果表明表达的σC蛋白具有良好的反应原性。3、重组NDRVσC蛋白的免疫原性的初步研究重组杆状病毒转染sf9昆虫细胞,aC蛋白可在细胞中大量表达,将表达的σC蛋白制备成疫苗,免疫1周龄的雏鸭,首免两周后加强免疫一次,结果表明：实验组一免2周后中和抗体产生,加强免疫后的抗体水平继续升高,中和抗体滴度可达到1：32,表明σC蛋白诱导机体产生了良好的免疫原性。免疫两周后,我们使用NDRV强毒对试验组进行攻击,发现免疫组得到良好的保护性,保护率可达70%。表明此蛋白对NDRV感染具有一定得免疫保护性,为后期研制有效的NDRV疫苗提供了基础。