研究背景糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是以心脏结构及功能紊乱为主要特征的糖尿病并发症,是糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病状态下心肌细胞及成纤维细胞可发生一系列改变,主要表现为心肌细胞表面积显著增加、心肌细胞肥大,晚期可造成细胞损伤及死亡。除可诱导心肌细胞肥大及死亡外,高糖环境还可促进成纤维细胞功能紊乱,纤维成分过量堆积,各类胶原比例失调。心肌纤维化可增加心肌僵硬度、降低心室顺应性。除此之外,研究发现糖尿病患者总冠脉阻力增加,最大冠脉血流减少,提示糖尿病患者中心肌组织存在微循环障碍。多种机制参与了 DCM的发生发展,其中高糖诱导的氧化应激产物增加是重要因素。糖尿病状态下活性氧(Reactive oxygen species,ROS)增多并刺激多种炎症因子表达升高。无菌性炎症反应在糖尿病心肌病的发生发展中发挥重要作用。研究发现炎症小体与糖尿病相关并发症密切相关,但黑色素瘤缺如因子2(Absentinmelanoma2,AIM2)炎症小体在糖尿病心肌病中的作用及分子生物学机制尚未阐明。炎症小体可通过多种与细胞死亡及免疫密切相关的信号激活,进而参与细胞炎症反应、焦亡、纤维化等调控过程,是与多种生理病理反应密切相关的一类蛋白复合体。研究表明炎症小体包括NLRs家族及AIM2家族等多个成员。AIM2炎症小体最早于1997年被报道,其属干扰素诱导的HIN-200家族。研究发现,AIM2蛋白在黑色素瘤中表达缺失,但其在其他多种组织及细胞中分布广泛,并在调节细胞焦亡、炎症反应及迁移增殖等过程中发挥重要作用。AIM2分布于细胞胞浆中,可识别细胞质中的双链DNA(Double strand DNA,dsDNA)并作出应答。dsDNA主要来源为外来细菌及病毒,因此AIM2在免疫过程中发挥重要作用。研究发现,AIM2在与dsDNA结合并激活后,可募集含有CARD结构域的凋亡相关颗粒样蛋白(ppoptosis-associated spepeck-like protein containing a caspase recruitment,ASC)形成炎症复合体,这一复合体可进一步募集并激活Caspase1蛋白,使其产生有活性的Caspase1 p10及p20片段。Caspase1作为一种半胱氨酸蛋白酶,可激活细胞质中的IL-1β及IL-18,并同时参与GSDMD-N介导的细胞焦亡过程。细胞焦亡又称为炎症性细胞坏死,是一种依赖于Caspase1的程序性死亡方式,存在着不同于凋亡或坏死等细胞损伤过程的特征性细胞形态改变。焦亡细胞除存在DNA片段式损伤外,还可出现GSDMD-N蛋白激活。GSDMD-N蛋白组装并与脂类结合,镶嵌在细胞膜上形成大量膜孔,完整的细胞膜逐渐解构,炎性因子通过膜孔流出,胞外物质通过膜孔流入,加速了细胞肿胀及细胞器的损伤,最终导致细胞破裂。电镜结果表明糖尿病状态下心肌细胞可呈现细胞肿胀、细胞膜孔道形成及线粒体肿胀空泡化等类似于焦亡细胞的形态特征。不仅如此,我们在前期实验中发现高糖处理H9c2心肌细胞可促进AIM2炎症小体表达升高。综上,我们提出假设:糖尿病状态下,心肌组织ROS增多并促进AIM2表达的过度激活,AIM2炎症小体的异常激活可促进IL-1β及GSDMD-N介导的炎症反应及细胞焦亡过程,进而导致心脏结构异常及功能紊乱。研究目的(1)建立2型糖尿病大鼠模型,探究AIM2炎症小体在DCM中的表达水平。(2)利用AIM2-shRNA慢病毒抑制糖尿病大鼠体内AIM2的表达,探究AIM2炎症小体对DCM的作用。(3)探究AIM2炎症小体作用于DCM发生发展的潜在分子生物学机制。研究方法1.2型糖尿病动物模型对实验动物进行一周适应性饲养后,将80只100-120g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4组(每组20只):对照组(Control组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+AIM2-shRNA慢病毒组(DM+shAIM2组)及糖尿病+阴性对照慢病毒组(DM+shNC组)。Control组大鼠进行基础饮食喂养(5%脂质,无胆固醇);其余组进行高脂饮食喂养(16%脂质,0.30%胆固醇)。4周后通过腹腔胰岛素耐量实验(Intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT)及腹腔葡萄糖耐量实验(Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)检测大鼠胰岛素抵抗水平。对高脂喂养后出现胰岛素抵抗的大鼠进行腹腔链脲佐菌素(Streptozocin,STZ,40mg/kg)注射,1周后进行空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)及胰岛素(Insulin,INS)检测,计算胰岛素敏感指数(Insulin sensitivity index,ISI)。STZ 注射后连续两次 FBG≥11.1mmol/L 者可作为 2型糖尿病模型成功标准。糖尿病模型构建成功后继续给予12周高脂喂养,12周后进行大鼠心脏功能检测。超声心动图显示大鼠出现左室收缩或舒张功能障碍则提示DCM模型产生。2.心脏超声大鼠进行异氟烷麻醉及胸部脱毛处理后,行经胸心脏彩超检测,收集左室舒张末期内径(Left ventricular end diastolic dimension,LVEDd)、左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室缩短率(Fractional shortening,FS)、E/A、e’/a’及E/e’等数值并进行大鼠心脏功能评估。3.慢病毒干预STZ腹腔注射8周后,分别对DM+shAIM2组及DM+shNC组大鼠进行尾静脉慢病毒注射,并于病毒注射2周后通过大鼠心肌组织冰冻切片检测慢病毒注射后心肌组织病毒转染效率。shAIM2序列为GGTCACCAGTTCCTC AGTT。动物模型中病毒干预时间为4周,随后行安乐死处理。4.血清学检测大鼠安乐死处理前一晚进行禁食处理,抽取外周静脉血,分别检测血清中空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG)、甘油三酯(Triglycerides,TG)及总胆固醇(Total Cholesterol,TC)含量。5.组织学检测大鼠实施安乐死后,称取大鼠体重及心脏重量,测量心脏大小并留取心脏图像。随后进行组织固定,并于乳头肌水平沿冠状面切取心脏组织进行石蜡切片。切片经脱蜡处理后进行组织学染色。6.心肌纤维化对心肌石蜡切片进行天狼猩红染色及Masson染色,使用Image-proplus软件分析心肌染色结果,评估心肌组织纤维化水平。7.免疫组织化学染色对心肌石蜡切片进行IL-1β免疫组织化学染色,观察IL-1β在组织中的分布情况。8.Western blot 检测提取大鼠左室心肌组织蛋白及H9c2心肌细胞蛋白,检测AIM2、pro-caspase1、caspase1、ASC、pro-IL-1β、IL-1β 及 GSDMD-N 的蛋白表达水平。9.心肌组织TUNEL检测通过TUNEL法检测大鼠心肌组织中心肌细胞的细胞核DNA损伤情况。10.细胞培养与处理将大鼠H9c2心肌细胞系使用低糖DMEM(5.5mM)+10%胎牛血清+青霉素、链霉素进行培养。通过无血清低糖DMEM培养基进行饥饿预处理后将细胞进行不同时间及浓度的糖刺激处理。11.心肌细胞siAIM2干预为探究AIM2在心肌细胞中的作用及调控机制,利用siAIM2对心肌细胞进行干预。siAIM2 序列为 GGUACCAGUUCCUCAGUUTT。12.细胞焦亡检测通过TUNEL法检测H9c2心肌细胞中细胞核DNA损伤水平,通过EthD-Ⅲ检测H9c2心肌细胞中细胞膜损伤水平。13.ROS检测在ROS抑制试验中,使用N-乙酸半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)预先抑制心肌细胞中ROS。DCFH-DA法及荧光法检测心肌细胞在高糖刺激后ROS的产生。14.数据分析通过SPSS v20.0及Graphpad 6进行数据处理。以均数士标准误来表示连续变量。利用独立样本t检验比较两组间的连续变量。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较多组间连续变量。当p<0.05时认为有统计学差异。研究结果1.2型糖尿病大鼠基本特征高脂饮食喂养4周后,糖尿病组大鼠的IPGTT和IPITT的曲线下面积(Areaunderthe curve,AUC)均显著高于普通饮食组大鼠。20周后,与对照组相比,糖尿病大鼠FBG、TC、TG、ISI和INS水平显著升高。DM+shAIM2组大鼠血浆TC、TG、FBG、ISI和INS水平与DM组相比未出现显著差异。同时,与DM组相比,DM+shAIM2组大鼠IPITT实验和IPGTT实验曲线下面积未出现显著差异。2.抑制AIM2表达可延缓糖尿病大鼠的心室重塑与对照组大鼠,DM组大鼠AIM2蛋白水平显著增加。我们也发现AIM2干扰慢病毒的干预下调了糖尿病引起的AIM2表达增加。此外,与DM组大鼠相比,DM+shAIM2组大鼠的心脏重量与体重之比显著降低。与对照组相比,DM组也显示出左心室肥大和较高的心肌细胞直径等特点,但AIM2干扰慢病毒处理后这些指标有显著改善。这些结果表明抑制AIM2表达可延缓DM大鼠的心室重塑。3.抑制AIM2表达可改善糖尿病引起的心脏功能障碍AIM2干扰慢病毒转染4周后进行超声心动图检测评估大鼠心脏功能。与对照组相比,DM组大鼠出现心脏功能障碍,表现为LVEF、FS、E/A和e’/a’比值显著降低。此外LVEDd、E/e’比值显著增加。不仅如此,与DM组相比,DM+shAIM2组大鼠上述指标有所好转。结果表明抑制AIM2表达可改善糖尿病引起的心脏收缩及舒张功能障碍。4.抑制AIM2可预防糖尿病引起的心肌纤维化Masson染色和天狼猩红染色表明,与对照组相比,糖尿病组大鼠心肌组织的细胞外基质增加,但抑制AIM2表达后细胞外基质含量减少。同时,与对照组相比,糖尿病组大鼠心肌组织表现出胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达增多,抑制AIM2显著降低了胶原Ⅰ和胶原Ⅲ蛋白水平。此外,通过shAIM2转染,MMP2和MMP9的升高水平也受到抑制。这些结果证明抑制AIM2可预防糖尿病引起的心肌纤维化。5.抑制AIM2可降低糖尿病诱导的心肌细胞死亡与对照组相比,DM组大鼠心脏组织中TUNEL阳性细胞比例明显增加,但是shAIM2转染减轻了这种现象。此外,Western blot检测结果显示,与对照组相比,DM组大鼠心肌组织中AIM2、caspase-1、IL-1β、ASC和GSDMD-N等蛋白质水平显著升高,AIM2干扰慢病毒干预后AIM2、caspase-1、IL-1β、ASC和GSDMD-N蛋白质水平显著下调。6.高糖处理H9c2心肌细胞后AIM2表达增加将H9c2细胞分别使用5.5mM葡萄糖的DMEM(对照组,NG)和含25mM葡萄糖(高糖组,HG)的DMEM进行干预,用甘露醇进行渗透压的平衡,其中HG组中分别使用25mM葡萄糖的DMEM处理6、12、24和48小时,结果发现,AIM2蛋白表达随着高糖刺激的时间延长而显著增加。分别使用5.5、11.1、22.2或33.3mM葡萄糖的DMEM培养基刺激H9c2心肌细胞24小时,并用甘露醇进行渗透压的平衡,结果发现,AIM2蛋白表达随着高糖刺激的浓度增加而显着增加。以上结果表明HG刺激促进心肌细胞中AIM2的表达。7.HG通过刺激心肌细胞中ROS的产生促进AIM2表达将H9c2细胞使用低糖及高糖DMEM进行干预,通过检测发现高糖刺激可显著促进ROS的产生。进一步使用ROS抑制剂NAC抑制ROS产生,我们发现与HG组相比,HG+NAC组中AIM2的表达显着下调。8.AIM2参与HG诱导的心肌细胞焦亡为探究AIM2是否参与了 HG诱导的细胞焦亡,使用siAIM2抑制H9c2心肌细胞中AIM2表达。与HG组相比,抑制AIM2降低了 ASC、caspase1、IL-1β、GSDMD-N水平。TUNEL和EthD-Ⅲ染色表明,与对照组相比,HG组中HG刺激促进了 H9c2心肌细胞中的DNA片段化和细胞膜穿孔;抑制AIM2后,与HG组相比,TUNEL 阳性细胞和EthD-Ⅲ阳性细胞的比例显著降低。研究结论(1)糖尿病大鼠出现心肌纤维化及心肌细胞死亡,心脏结构异常及功能紊乱。(2)糖尿病大鼠心肌组织中AIM2炎症小体表达显著升高。(3)利用AIM2干扰慢病毒进行体内干预,心肌组织中AIM2表达被显著抑制。(4)AIM2沉默显著改善糖尿病诱导的心肌结构异常与功能紊乱。(5)高糖刺激可通过促进心肌细胞中ROS表达增多增加AIM2炎症小体表达,进一步诱导caspase-1/GSDMD-N介导的细胞焦亡。(6)心肌细胞中AIM2沉默可缓解GSDMD-N介导的细胞焦亡。研究背景糖尿病作为全球范围内的主要慢性疾病之一,已成为临床防治工作的重中之重。作为糖尿病患者的主要并发症,糖尿病心肌病是糖尿病患者死亡的重要原因之一。区别于冠状动脉粥样硬化、高血压、病毒等因素引起的继发性心脏病,糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是由糖尿病所引发的心肌结构与功能紊乱的一类原发性心肌疾病。糖尿病可加速心室重塑的病理进程,进而导致心肌舒张及收缩功能障碍,最终引发心力衰竭甚至死亡。既往研宄表明高血糖、胰岛素抵抗、代谢异常、氧化应激及钙离子超载等多种因素共同促进了心肌组织中纤维化及细胞凋亡的发生,导致了DCM的发生与发展。目前有效控制血糖依旧是DCM治疗中的基本手段,但随着研宄的深入,新的治疗方法正被不断探索。除保护心肌的药物治疗外,超声靶向微泡破坏技术(UTMD)、细胞移植等在修复甚至替换受损心肌中可能发挥重要作用的新技术也成为了DCM研究的热点。尼可地尔(N-2-(羟基乙基)烟酰胺硝酸酯)是一种抗心绞痛药物,是最早应用于临床的ATP敏感的钾离子通道(ATP-dependent K channel,K+ATP通道)开放剂,同时尼可地尔具有类硝酸酯作用,可释放一氧化氮(NO)。尼可地尔适用于多种类型的心绞痛,可有效减少心血管事件发生风险,改善预后。基础研宄表明尼可地尔在多种心血管疾病中发挥保护作用。在大鼠心肌梗死模型中,尼可地尔可通过开放K+-ATP通道抑制PKC激活,预防Ca2+超载减轻心室前负荷及后负荷,提高心肌灌注量。不仅如此,尼可地尔在糖尿病诱导的血管增生及慢性肾脏疾病中可有效抑制氧化应激,延缓疾病进程。但尼可地尔是否可延缓糖尿病心肌病病程及相关机制尚未阐明。PI3K/Akt通路作为人体内重要的促生存的信号通路,可对糖尿病心肌病的发生及发展起到保护作用。:PI3K/Akt通路可通过调节血糖水平、调节脂质代谢、保护内皮细胞、减轻炎症、抵抗纤维化、缓解心肌细胞凋亡等方面增强糖尿病状态下心肌细胞活性及心脏功能。同时PI3K/Akt通路下游因子mTOR及eNOS的激活有助于缓解细胞凋亡。既往研究发现糖尿病状态下PI3K/Akt通路受到抑制,凋亡水平增加。但是,尼可地尔是否可通过磷酸化PI3K/Akt通路进而激活mTOR及eNOS改善高糖诱导的心肌细胞凋亡目前尚未见报道。综上所述,本课题组拟通过构建DCM大鼠模型,探宄尼可地尔在DCM发生发展中的作用,并探讨尼可地尔是否可通过调控PI3K/Akt通路发挥心肌保护作用,进一步探究PI3K/Akt在DCM中潜在作用。研究目的(1)建立2型糖尿病大鼠模型并给予尼可地尔药物治疗,探宄尼可地尔治疗对DCM发生发展的作用。(2)体内探宄尼可地尔治疗对2型糖尿病大鼠心肌组织凋亡及纤维化的作用。(3)体外探宄尼可地尔对高糖刺激后心肌细胞凋亡的作用及分子生物学机制。研究方法1.DCM大鼠模型选取60只100-120g Sprague-Dawley大鼠并随机分为四组:Control组,DM组,DM+N7.5组,DM+N15组。糖尿病模型构建方法同第一部分。对照组给予基础饮食,另外三组进行高脂喂养4周后进行IPITT及IPGTT检测,选取胰岛素抵抗大鼠,并进行腹腔STZ注射(40mg/kg)。空腹血糖l.lmmol/L者被认为造模成功。2型糖尿病模型造模成功8周后,通过饮水法以7.5mg/kgday及15mg/kg_day的浓度给予糖尿病大鼠尼可地尔药物治疗。药物干预4周后给予IPITT及IPGTT测试,所有检测完成后进行安乐死处理。动物实验的操作程序符合山东大学动物伦理委员会要求。2.心脏超声药物干预4周后进行大鼠心脏功能检测。大鼠行异氟烷麻醉后进行胸部脱毛。Vevo 770小动物心脏超声仪系统进行大鼠心脏超声检测,收集LVEF、FS、LVEDd、E/A、eVa’、E/e,等指标。3.血清学检测动物安乐死前一晚进行禁食处理,当日进行空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)检测;并进行心尖取血留取血清检测甘油三酯(Total triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)等指标。4.组织学检测留取大鼠体重及心脏重量等数据,测量心脏大小并留取心脏图像。对留取的大鼠组织进行固定处理,并将心脏组织在乳头肌水平沿冠状面切取3-5mm组织进行石蜡接片。切片经脱蜡处理后进行HE等组织学染色。5.心肌纤维化染色心肌组织切片行Masson染色及天狼猩红染色。使用Image-proplus对纤维化水平进行评估。6.免疫组织化学检测对心肌石蜡切片进行Collagen I、Collagen III等指标的免疫组织学染色,并对Collagen I、Collagen III在心肌组织中的含量进行评估。7.细胞培养与处理H9c2心肌细胞培养时所用培养基为低糖DMEM(5.5mM)+10%胎牛血清+双抗。细胞在进行处理前,进行无血清培养基饥饿过夜处理。对细胞所进行的各项干预及处理条件为:(1)尼可地尔梯度处理:N1:lOumol;N2:50umol;N3:lOOumol。(2)作为尼可地尔的受体竞争剂,以50〇nmol的浓度加入5-轻基癸酸(5-hydroxydecanoate,5-HD)可抑制尼可地尔对受体的结合。(3)米替福新(MTF,miltefosine,lOOpmol)及雷帕霉素(Rapa,rapamycin,lOOpmol)被用来抑制PI3K/Akt通路。8.Western blot检测提取大鼠心肌组织蛋白,进行CollagenI、Collagenlll、MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax、cleavedcaspase3、caspase3等蛋白的表达情况.。提取心肌细胞蛋白,利用Western blot方法检测心肌细胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase3、caspase3、p-eNOS、eNOS、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR及mTOR等蛋白的表达情况。9.TUNEL检测利用TUNEL法检测大鼠心肌组织及H9c2心肌细胞中细胞凋亡水平。10.数据分析通过SPSS v20.0及Graphpad6进行数据处理。以均数土标准误来表示连续变量。利用独立样本t检验比较两组间的连续变量。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较多组间连续变量。当p<0.05时认为有统计学差异。研究结果1.尼可地尔治疗可延缓糖尿病大鼠的心室重塑与对照组相比,DM组大鼠心脏体积显著增加,左室尤甚;心腔扩大,左室壁肥厚。左心室HE染色提示,与对照组相比,DM组大鼠心肌组织排列紊乱,炎性细胞增多;心肌细胞直径显著增加;心脏重量显著增加,心脏重量/体重比值升高。应用尼可地尔药物治疗后,与DM组大鼠相比,DM+N7.5组及DM+N15组的大鼠心室重塑过程改善:心脏体积减小,向心性肥厚程度减低,心肌细胞直径减小,心脏重量与体重之比显著降低。这些结果表明尼可地尔药物治疗可延缓DM大鼠的心室重塑。2.尼可地尔治疗可改善糖尿病引起的心脏功能障碍尼可地尔药物治疗4周后对各组大鼠进行超声心动图检测。与对照组相比,DM大鼠左室短轴缩短率(FS)降低、左室射血分数(LVEF)显著降低,E/A比值显著降低;同时DM组大鼠eVa’比值显著降低,左室舒张末期内径(LVEDd)、E/d比值显著增加。提示罹患2型糖尿病的大鼠在患病16周时可出现心脏收缩功能及舒张功能障碍。与DM组相比,DM+N7.5组及DM+N15组大鼠LVEF、FS、E/A、e’/a?显著增加,LVEDd、E/e’显著降低,提示抑制尼可地尔药物治疗4周后可改善糖尿病引起的大鼠心脏功能障碍。3.尼可地尔治疗可改善糖尿病引起的心肌纤维化Masson染色和天狼猩红染色显示,与对照组相比,糖尿病组大鼠心肌组织的细胞外基质增加,但尼可地尔药物治疗后心脏中细胞外基质含量减少。同时,与对照组相比,糖尿病组大鼠心肌组织胶原I、胶原III、基质金属蛋白酶2(MMP2)及基质金属蛋白酶9(MMP9)增加,尼可地尔药物治疗显著降低了上述蛋白水平。这些结果证明尼可地尔药物治疗可预防糖尿病引起的心肌纤维化。4.尼可地尔治疗可降低糖尿病大鼠心脏中的心肌细胞凋亡对4组大鼠心肌组织切片进行TUNEL染色。与对照组相比,DM组大鼠心脏组织中TUNEL阳性细胞比例明显增加。与DM组相比,DM+N7.5组及DM+N15组大鼠心肌组织中TUNEL阳性细胞比例明显减少。不仅如此,Western blot检测结果显示,与对照组相比,DM组大鼠心肌组织中Bax、cleaved caspase-3等蛋白质水平显著升高,bcl-2及eNOS等蛋白质水平显著降低。与DM组相比,DM+N7.5组及DM+NI5组大鼠心肌组织Bax、cleaved caspase-3等蛋白质水平显著降低,bcl-2及eNOS等蛋白质水平显著升高。5.尼可地尔处理可降低高糖诱导的H9c2心肌细胞调亡将H9c2细胞随机分为5组:NG组(正常糖组,5.5mM)、HG组(高糖组,33.3mM)、HG+Nl(高糖组+10^lmol尼可地尔)、HG+N2(高糖组+50^lmol尼可地尔)、HG+N3(高糖组+100jimol尼可地尔),用甘露醇进行渗透压的平衡。Western blot检测发现,与NG组相比,HG组Bax、cleaved caspase-3等蛋白质水平显著升高,bcl-2及eNOS等蛋白质水平显著降低。尼可地尔药物治疗后凋亡水平显著改善,且lOOpmol时凋亡相关蛋白改善效果最佳。6.尼可地尔对凋亡的保护作用可被5-HD阻滞5-HD是线粒体K+-ATP通道选择性抑制剂,可与尼可地尔竞争性结合K+-ATP通道。使用5-HD与尼可地尔进行共处理,将细胞随机分为四组:NG组;HG组;HG+N组;HG+N+5-HD组。TUNEL染色表明,与单纯HG组相比,尼可地尔(lOOpmol)处理后TUNEL阳性细胞的比例显著降低,而5-HD与尼可地尔共处理可部分逆转这一保护作用。Western blot检测发现,与HG组相比,尼可地尔药物治疗(lOOpmol)后Bax、cleavedcaspase-3等蛋白质水平显著降低,bcl-2及eNOS等蛋白质水平显著升高。与单纯尼可地尔处理组相比,5-HD共处理组的凋亡相关蛋白表达水平被部分逆转,说明5-HD可部分逆转尼可地尔对凋亡的保护作用。另外,Western blot检测发现,尼可地尔药物处理组P-PI3K、p-Akt、p-eNOS及p-mTOR蛋白水平显著增加,5-HD共处理可部分逆转这一改变。7.尼可地尔可通过PI3K/Akt通路缓解髙糖诱导的心肌细胞调亡米替福新(MTF,Miltefosine)为Akt抑制剂,雷帕霉素(Rapa,Rapamycin)为mTOR抑制剂。将细胞随机分为五组:NG组;HG组;HG+N组;HG+N+MTF组;HG+N+Rapa组。TUNEL染色表明,与NG组相比,HG组TUNEL阳性细胞的比例显著增加,尼可地尔处理后TUNEL阳性细胞的比例显著降低,而MTF或Rapa与尼可地尔共处理可部分逆转这一保护作用。Western blot检测发现,与HG组相比,尼可地尔药物治疗(lOOpmol)后Bax、cleaved caspase-3等蛋白质水平显著降低,bcl-2及eNOS等蛋白质水平显著升高。与单纯尼可地尔处理组相比,MTF或Rapa处理组的H9c2心肌细胞中Bax、cleaved caspase-3等蛋白质水平升高,bcl-2及eNOS等蛋白质水平显著降低,说明尼可地尔可通过PI3K/Akt通路调节高糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡。研究结论(1)糖尿病大鼠通过尼可地尔治疗后可改善其心肌组织纤维化及心肌细胞凋亡程度。(2)糖尿病大鼠通过尼可地尔治疗后可改善其心脏功能障碍。(3)尼可地尔可降低高糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡而5-HD可阻断其作用。(4)作为NO供体,尼可地尔还可通过PI3K/Akt通路缓解高糖诱导的心肌细胞凋亡。