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赖氨酸(Lysine,Lys)是猪玉米-豆粕型日粮的第一限制性氨基酸,与猪的生长速度、蛋白质沉积和肌纤维发育及其特性密切相关,为了揭示日粮赖氨酸含量对肥育猪肌纤维特性的影响及其分子机理,本研究开展了5个试验,可分为动物试验和细胞培养试验两部分。动物试验主要研究赖氨酸对肥育猪肌纤维直径、肌纤维密度、蛋白质代谢相关酶活性、脂肪代谢相关酶活性、脂肪细胞直径、背最长肌脂肪酸组成和风味物质含量、背最长肌基因表达谱的影响;细胞培养试验主要研究赖氨酸对体外培养骨骼肌卫星细胞的增殖、细胞周期、蛋白质代谢相关酶活性以及基因表达量的影响。
动物试验选择144头遗传背景一致,平均体重为60kg的杜×长×大三元杂肥育猪,按体重和性别随机分为3个处理,每处理3个重复,每个重复16头猪。基础日粮为玉米豆粕型,参考NRC(1998)营养标准设计。试验日粮是在基础日粮的基础上添加赖氨酸组成,共3个日粮处理,其日粮总Lys水平分别为0.65％、0.75％、1.05％,试猪饲养至100kg体重时试验结束。试验结束时,每个重复选择2头(1公1母)接近其平均体重的试猪屠宰,采集背最长肌、斜方肌、腰大肌、背部皮下脂肪、肝脏样品,置于液氮中保存待测;细胞培养试验选用1头1日龄杜×长×大三元杂仔猪,在无菌条件下屠宰并分离背最长肌进行骨骼肌卫星细胞的原代培养。使用含不同浓度赖氨酸的培养液处理骨骼肌卫星细胞并进行相关指标测定。结果表明:
1.与日粮赖氨酸含量0.65％组(对照组)相比,赖氨酸含量为0.75％时显著增加了肥育猪背最长肌肌纤维直径(P＜0.05)和背最长肌中CAST活性(P＜0.05),极显著降低了背最长肌中CAPN的活性(P＜0.01),但日粮赖氨酸含量对各肌肉组织肌纤维密度、斜方肌、腰大肌肌纤维直径以及肌间脂肪组织和背部脂肪组织中脂肪细胞直径无显著影响(P＞0.05)。赖氨酸含量0.75％组与1.05％组之间上述指标的差异不显著(P＞0.05)。日粮赖氨酸含量对肥育猪背最长肌、背部脂肪组织和肝脏中FAS和LPL活性均无显著影响(P＞0.05)。
2.与日粮赖氨酸含量0.65％组相比,日粮赖氨酸含量0.75％组和1.05％组显著提高了背最长肌中肌苷酸的含量、C14:0、C18:2的比例(P＜0.05),极显著提高了PUFA的比例(P＜0.01),但0.75％组与1.05％组之间未发现显著差异(P＞0.05)。与日粮赖氨酸含量0.65％组相比,日粮赖氨酸含量1.05％组显著提高了C16:0的比例,但0.65％组与0.75％组之间、0.75％组与1.05％组之间未发现显著差异(P＞0.05)。
3.与日粮赖氨酸含量0.65％组相比,日粮赖氨酸0.75％组试猪背最长肌的基因表达谱存在明显差异。在全部差异基因中,与细胞组成相关基因占16％,与分子功能相关的基因占27％,与生物过程相关的基因占16％;通过GO分析,发现动物机体生物代谢过程中的8条通路发生了显著变化(P＜0.05);综合考虑动物体蛋白质代谢和肌纤维生长发育及特性,筛选出6个与肌纤维发育和特性密切相关的差异基因做为下一步研究的主要候选基因。
4.实时荧定量PCR方法验证基因芯片结果稳定可信。
5.赖氨酸对骨骼肌卫星细胞的增殖有促进作用,浓度为0.1mmol/L时作用显著(P＜0.05)。赖氨酸能显著降低G0-G1期细胞的百分率,明显提高S期细胞的百分率(P＜0.05)。赖氨酸显著降低了骨骼肌卫星细胞中CAPN的活性(P＜0.05)。在mRNA水平上,赖氨酸显著提高了骨骼肌卫星细胞中AMPD1、CAST、MEF2C和CAMK2G基因的表达量(P＜0.05),明显降低了CAPN3基因的表达量(P＜0.05)。
上述结果显示,赖氨酸主要通过增加肌纤维直径促进肌肉生长;赖氨酸能提高背最长肌中肌苷酸含量、改变背最长肌脂肪酸的组成比例;赖氨酸可能通过降低CAPN3基因的表达量,提高CAST、MEF2C和基因的表达来调节肌肉蛋白质沉积;赖氨酸可能通过提高AMPD1基因的表达量、增加肌肉中肌苷酸的含量这一途径影响肉的风味:赖氨酸可能还通过提高CAMK2G、PPP3CA的表达来影响肌肉的肉色。