论文部分内容阅读
目的分别建立人冠状病毒NL63(Human Coronavirus NL63)和人冠状病毒HKU1( Human Coronavirus HKU1)的实时荧光定量PCR(Real-time Fluorescent Quanti- tative PCR,FQ-PCR)方法检测并了解福州地区急性呼吸道感染(ARTI)患儿HCoV-NL63与HCoV-HKU1感染情况。方法分别设计HCoV-NL63多聚酶蛋白1a基因、HCoV-HKU1 pol基因的引物和Taqman探针。扩增1a基因片段、pol基因片段并将其克隆到PMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR检测方法,建立标准曲线,进行敏感性、特异性试验,重复性试验。用建立好的荧光定量PCR检测收集到的151份临床ARTI患儿标本中两种病毒的感染情况,对结果进行比较分析。扩增HCoV-NL63核衣壳蛋白N基因与包膜蛋白E基因,对其序列进行初步分析。结果1、建立的FQ-PCR方法检测HCoV-NL63,线性范围为101 copies/μl～109copies /μl,批内变异系数为0.9%,批间变异系数为1.6%。用建立的HCoV-NL63实时荧光定量PCR方法检测2008-2009年度冬春季151例临床标本,共检出阳性2例,阳性率为1.3%(2/151)。普通PCR法检测结果与FQ-PCR检测结果一致。2、福州地区HCoV-NL63的N基因核苷酸序列,氨基酸序列与GenBank中登录的原型株HCoV-NL63的N基因一致性均达97%以上,氨基酸序列与原型株有3个氨基酸的改变。HCoV-NL63的E基因核苷酸序列与GenBank中登录的原型株一致性达99%以上,氨基酸序列与原型株完全相同。3、建立的FQ-PCR方法检测HCoV-HKU1,线性范围为102copies/μl～109copies /μl,批内变异系数为1.2%,批间变异系数为0.5%。用建立的HCoV-HKU1实时荧光定量PCR方法检测151例临床标本,未检出阳性标本。但用本法检测先前本实验室保存的2006-2007年度用普通RT-PCR检测出的一份HCoV-HKU1阳性标本,也显示阳性。结论1、本研究建立的HCoV-NL63、HCoV-HKU1 FQ-PCR检测方法灵敏度、重复性、特异性均较好,可用于临床呼吸道标本的检测以及流行病学监测。2、福州地区HCoV-NL63的N基因、E基因均与原型株同源性高。3、福州地区2008-2009年度冬春季急性呼吸道感染患儿中,存在比较低的HCoV-NL63感染率。150例ARTI患儿标本中未检测到HCoV-HKU1提示该病毒在本地区患儿中感染率更低。