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肝癌在中国具有较高的发病率和死亡率,其复发和转移是目前影响肝癌预后的主要原因。随着分子生物学及其技术的发展,肝癌发生、发展、复发和转移的分子机制逐渐被揭示,目前肝癌的靶向治疗和精准诊疗也逐渐成为研究的热点。很多研究证实mi RNA在肿瘤的发生和发展中起着重要的调控作用,它通过与目标m RNA的3′-UTR区结合,在转录后水平进行特异性沉默目标基因,进而促进或抑制肿瘤生长、复发或转移。我们前期研究表明,mi R-27a在肝癌细胞系Hep G2、Huh7等中的含量高于正常肝细胞L02,且肝癌病人肿瘤组织中mi R-27a含量高于癌旁组织;培养的肿瘤细胞中加入外源性mi R-27a,将促进肿瘤细胞的生长,这些都说明mi R-27a是具有致癌作用的mi RNA。为了证明mi R-27a可能是肝癌转移治疗的一个潜在靶标,我们首先通过生物信息学的方法确定了mi R-27a与肝癌转移的相关性并筛选出可能的下游靶基因,选择Target Scan、Pic Tar、mi RBase三个数据库进行聚类分析,再结合文献查询中与肿瘤转移相关性的强弱,初步锚定SFRP1(Secreted frizzled related protein 1)是mi R-27a的下游靶标,二者存在负性调控关系。另有报道,在肝癌细胞中,SFRP1基因的启动子可通过频繁的DNA甲基化而沉默SFRP1的表达,进而激活Wnt/β-catenin信号通路,与它在正常肝细胞中的非甲基化状态形成对比。当恢复SFRP1的表达后,Wnt/β-catenin信号通路会受到抑制。经典的Wnt/β-catenin信号通路能够调控多种癌症的转移,β-catenin表达上调能够激活Wnt/β-catenin信号通路,使其发挥促肿瘤转移的作用。基质金属蛋白7(MMP7)是β-catenin信号通路中与转移相关的下游靶基因。因此,我们提出假设mi R-27a可能通过抑制下游SFRP1,激活Wnt/β-catenin信号通路,从而达到促进肿瘤转移的作用。本研究将肝癌细胞中的mi R-27a作为治疗靶点,利用寡聚核苷酸antimi R-27a与mi R-27a互补的原理来抑制内源性mi R-27a的功能。为了解决anti-mi R-27a易被核酸酶降解及靶向肝癌细胞的关键问题,本实验利用透明质酸(HA)靶向肝癌细胞CD44受体的特性,用HA-PEI包裹anti-mi R-27a构建纳米复合粒子,将anti-mi R-27a包裹在纳米粒子的中心,HA暴露在纳米粒子的表面,通过HA识别Hep G2细胞表面的CD44受体,介导HA-PEI/anti-mi R-27a纳米复合粒子内吞聚集于Hep G2细胞中,研究该纳米粒子对Hep G2细胞迁移作用的影响。目的:本论文主要研究HA-PEI/anti-mi R-27a纳米复合粒子对肝癌Hep G2细胞迁移作用的影响,寻找mi R-27a作用的下游靶标和转移相关的信号通路,探讨HA-PEI/anti-mi R-27a纳米复合粒子抑制Hep G2细胞迁移作用的分子机制,为HA-PEI/anti-mi R-27a治疗肝癌转移提供理论与实践基础。方法:RT-PCR法确定HA-PEI/anti-mi R-27a纳米复合粒子在体外酸性环境下的p H响应性释放情况;MTT法测定HA-PEI/anti-mi R-27a纳米粒子对Hep G2细胞迁移的适宜浓度;划痕实验和Transwell小室法模拟细胞迁移模型,设立空白对照组、HA-PEI组、HA-PEI/anti-mi R-27a N.C组(阴性对照)和HA-PEI/anti-mi R-27a组进行实验;粘附实验检测HA-PEI/anti-mi R-27a纳米复合粒子对Hep G2细胞与胞外基质间以及细胞间粘附情况的影响;Western blot法检测mi R-27a下游与转移相关的蛋白SFRP1、β-catenin、MMP7的表达情况。结果:HA-PEI/anti-mi R-27a纳米复合粒子能够通过靶向细胞膜表面CD44受体进入细胞,并在肿瘤的酸性环境下,释放出anti-mi R-27a与细胞内的mi R-27a相互作用;HA-PEI/anti-mi R-27a纳米复合粒子对肝癌细胞的迁移具有靶向抑制作用,适宜浓度是50 n M;对Hep G2细胞与胞外基质以及细胞间的粘附作用具有一定的抑制作用;HA-PEI/anti-mi R-27a纳米复合粒子能够提高Hep G2细胞中SFRP1蛋白的表达(P<0.05),降低Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和MMP7蛋白的表达(P<0.05)。结论:HA-PEI/anti-mi R-27a纳米复合粒子具有靶向抑制Hep G2细胞迁移的作用,主要通过在肿瘤细胞酸性环境条件下释放出anti-mi R-27a,与细胞内的mi R-27a相互作用,抑制Hep G2细胞的迁移。其机制可能是通过升高Wnt/β-catenin信号通路中SFRP1蛋白,降低β-catenin蛋白表达来实现的。