阻滞NRF2后砷对NRF2抑制因子的影响及与MAPK基因关系

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目的:NRF2基因抑制的人角质形成细胞株HaCaT细胞为模型细胞,阻滞NRF2对NRF2抑制因子的影响及与MAPK基因关系,为砷致皮肤毒性机制提供理论依据。  方法:1、NRF2 shRNA的构建:以人源NRF2基因为靶基因,设计与NRF2基因具有特异性的小干扰RNA,构建其shRNA,重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定。2、慢病毒包装:用重组后表达成功的载体转染并包装细胞293T,收集、浓缩病毒上清液、测定其滴度。3、抑制NRF2基因的Hacat细胞模型的构建,构建好的三种慢病毒分别感染HaCaT细胞(MOI=5),感染48小时后,用1μg/ml的嘌呤霉素筛选稳定细胞株。4、稳定细胞株的鉴定:筛选出稳定的细胞株后,用实时荧光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)检测干扰效率。5、细胞培养与砷处理:所用细胞均按细胞常规培养方法进行培养。6、MTT法检测细胞生长状况,确定砷处理浓度,砷处理浓度别为以毒理学标准的LC50的1/100、1/50、1/10。7、流式细胞仪检测细胞活性氧。8、实时荧光定量PCR检测细胞中Nrf2、KEAP1、N6AMT1、Bach1、MAPK/ERK mRNA的表达水平。9、ELISA法检测细胞中GSH、N6AMT1、COX-2的蛋白表达水平。  结果:1、慢病毒干扰载体构建测序结果显示重组载体构建成功。2、慢病毒滴度测试结果:依据滴度(TU/ml)=细胞数×百分比×MOI(1)×病毒稀释倍数×103选取最佳滴度的病毒。3、选取NRF2 shRNA3 Hacat细胞,其基因的抑制效率为87%。4、砷处理低、中、高剂量组分别为2.10μmol/L、4.20μmol/L、21.00μmol/L,抑制Nrf2、抑制Keap1、空白对照组砷处理浓度为0μmol/L。5、细胞增殖:2.10μmol/L砷处理细胞,细胞出现增殖现象;4.20μmol/L砷处理细胞在72h开始出抑制;21.00μmol/L砷处理细胞48h开始明显抑制细胞。空白组细胞增值率略低于抑制Keap1对照组,高于抑制Nrf2对照组。6、活性氧(ROS)在空白组表达较高随时间变化趋向稳定,抑制Keap1基因ROS表达上调,抑制Nrf2基因ROS降低,砷处理后ROS下调。7、2.10μmol/L、4.2μmol/L砷处理抑制Nrf2基因的细胞8h、24h后促进Bach1、N6AMT1、MAPK/ERK mRNA的表达;21.00μmol/L砷处理72h可使抑制Nrf2基因的细胞中Bach1、N6AMT1、MAPK/ERK mRNA表达下调,差异有统计学意义(P<0.001)。8、2.10μmol/L、24h砷处理的抑制NRF2基因的HaCaT细胞能使N6AMT1、COX-2、GSH蛋白的表达上调;72h、29.00μmol/L砷处理抑制NRF2基因的HaCaT细胞使N6AMT1、COX-2、GSH蛋白的表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);  结论:1、砷具有低促效应。2、N6AMT1能够调控氧化与抗氧化水平。3、GSH调节细胞氧化水平。4、ROS在体内有维持动态平衡。5、Bach1、COX-2能够参与抗氧化反应。6、MAPK/ERK会激活COX-2的表达。
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