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为了筛选参与地黄(Rehmannia glutinosa L.)毛蕊花糖苷生物合成相关的转录因子，在地黄转录组数据库中鉴定出具有完整开放阅读框(ORF)的WRKY基因转录本，分析诱导子处理后WRKY基因的表达特征，以及WRKY在地黄不同组织中的时空表达模式，确定可能参与毛蕊花糖苷合成的关键WRKY基因。为了研究候选WRKY基因的功能，建立了地黄的基因编辑体系。利用过量表达和基因编辑技术研究了其中一个关键候选基因RgWRKY37基因在毛蕊花糖苷生物合成中的功能。主要研究内容及结果如下:
1.在地黄转录组数据库中，应用生物信息学分析，鉴定获得37条具有完整ORF的RgWRKY基因的cDNA序列。37条cDNA序列推导编码的蛋白均有典型WRKY结构域，其中12个WRKY蛋白属于Ⅰ亚家族，20个属于Ⅱ亚家族，5个属于Ⅲ亚家族。根据水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和H2O2处理的地黄毛状根中37个RgWRKY基因的表达特性，结合诱导子处理后毛蕊花糖苷的积累规律，筛选出8个候选的RgWRKY基因。利用RNA-seq和qRT-PCR检测WRKY基因在地黄12个不同组织中的表达模式，并用高效液相色谱法测定地黄12个部位毛蕊花糖苷含量，根据RgWRKY基因与毛蕊花糖苷积累的相关性，确定了5个最可能参与调控毛蕊花糖苷生物合成的候选RgWRKY基因，选择其中一个候选基因RgWRKY37进行基因功能验证。
2.利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了地黄的RgWRKY37基因，发现RgWRKY37基因的编码区序列长度为936bp，编码312个氨基酸，进化分析表明，RgWRKY37属于WRKY家族GroupⅢ亚家族成员，具有典型的WRKYdomain和C-X7-C-X23-H-X1-C基序锌指结构基序。亚细胞定位发现RgWRKY37蛋白分布在细胞核中，是核蛋白。克隆RgWRKY37的编码区序列，利用酶切连接成功构建了过量表达载体pBI121-RgWRKY37。利用发根农杆菌介导法将载体导入地黄基因组，最终获得19个毛状根株系，其中11个株系在含卡那霉素的培养基上生长良好，PCR证实这11个地黄毛状根株系为阳性株系。挑选长势较好的6个阳性转基因毛状根株系与3个对照株系进行液体悬浮培养，检测结果发现，过量表达RgWRKY37的所有株系毛蕊花糖苷含量和总苯乙醇苷含量均极显著高于对照株系，说明RgWRKY37基因是毛蕊花糖苷合成的正调控转录因子。
3.为了构建地黄的基因编辑体系，克隆了地黄的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因，发现该基因具有一个1977bp的开放阅读框，编码587个aa，具有Rossmannfolddomain、HotDogfoldlikedomain和hydrophobicchanneldomain这些PDS蛋白的典型结构域，命名为RgPDS1。利用基因组文库比对组装，对gap区域设计特异引物扩增并测序，最终获得了7667bp的RgPDS1基因组序列。RgPDS1的基因组序列包含14个内含予，15个外显子。cDNA和基因组DNA序列分别提交在NCBI，注册号分别为MW132596和MW132597。利用qRT-PCR分析了RgPDS1的表达模式，发现RgPDS1在地黄不同部位(组织)均具有表达，在叶和花中的表达量相对较高。在RgPDS1的第4外显子上设计靶序列，克隆到载体pKSE401上。利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法，获得11个白化苗株系。11株白化苗中，6株苗呈完全白化，5株苗呈不同程度白化，属于嵌合体和杂色。取其中8株进行突变位点检测，测序结果表明，8株白化苗的靶点序列均出现不同程度的变异，证明白化表型是由于碱基变化造成的。株系5白化苗叶片中的叶绿素a、叶绿素b和总类胡萝卜素均显著低于野生型，块根中的类胡萝卜素含量仅有野生型块根的1.83％。建立的高效基因编辑体系为进一步研究WRKY基因在地黄毛蕊花糖苷生物合成中的分子功能奠定基础。
4.RgWRKY37基因编辑载体的构建和遗传转化。用地黄基因组DNA为模板进行PCR扩增并测序，获得长度为1597bp的RgWRKY37的基因组序列，分析表明RgWRKY37基因包含2个内含子。在第一个外显子上靠近ATG的位置设计一个sgRNA靶点序列，克隆到载体pKSE401上，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法进行地黄叶片转化，共获得抗性愈伤89个，分化出160株再生苗，其中77株具有良好的卡那霉素抗性。对株系进行阳性鉴定后，取15株阳性株系的地黄块根进行总苯乙醇苷和毛蕊花糖苷含量测定，发现所有检测株系的块根中毛蕊花糖苷含量均显著低于对照，10个株系(2/3)的总苯乙醇苷含量显著低于野生型对照。选择其中6个株系利用T克隆检测靶位点的序列变异情况，发现这6个株系在靶位点均存在碱基突变。说明RgWRKY37基因发生突变后，造成蛋白质功能的改变或丧失，进而导致地黄块根中苯乙醇苷和毛蕊花糖苷生物合成受影响。证明CRISPR/Cas9系统有效的实现了对RgWRKY37的基因编辑，RgWRKY37是地黄毛蕊花糖苷生物合成的正向调控因子。
1.在地黄转录组数据库中，应用生物信息学分析，鉴定获得37条具有完整ORF的RgWRKY基因的cDNA序列。37条cDNA序列推导编码的蛋白均有典型WRKY结构域，其中12个WRKY蛋白属于Ⅰ亚家族，20个属于Ⅱ亚家族，5个属于Ⅲ亚家族。根据水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和H2O2处理的地黄毛状根中37个RgWRKY基因的表达特性，结合诱导子处理后毛蕊花糖苷的积累规律，筛选出8个候选的RgWRKY基因。利用RNA-seq和qRT-PCR检测WRKY基因在地黄12个不同组织中的表达模式，并用高效液相色谱法测定地黄12个部位毛蕊花糖苷含量，根据RgWRKY基因与毛蕊花糖苷积累的相关性，确定了5个最可能参与调控毛蕊花糖苷生物合成的候选RgWRKY基因，选择其中一个候选基因RgWRKY37进行基因功能验证。
2.利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了地黄的RgWRKY37基因，发现RgWRKY37基因的编码区序列长度为936bp，编码312个氨基酸，进化分析表明，RgWRKY37属于WRKY家族GroupⅢ亚家族成员，具有典型的WRKYdomain和C-X7-C-X23-H-X1-C基序锌指结构基序。亚细胞定位发现RgWRKY37蛋白分布在细胞核中，是核蛋白。克隆RgWRKY37的编码区序列，利用酶切连接成功构建了过量表达载体pBI121-RgWRKY37。利用发根农杆菌介导法将载体导入地黄基因组，最终获得19个毛状根株系，其中11个株系在含卡那霉素的培养基上生长良好，PCR证实这11个地黄毛状根株系为阳性株系。挑选长势较好的6个阳性转基因毛状根株系与3个对照株系进行液体悬浮培养，检测结果发现，过量表达RgWRKY37的所有株系毛蕊花糖苷含量和总苯乙醇苷含量均极显著高于对照株系，说明RgWRKY37基因是毛蕊花糖苷合成的正调控转录因子。
3.为了构建地黄的基因编辑体系，克隆了地黄的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因，发现该基因具有一个1977bp的开放阅读框，编码587个aa，具有Rossmannfolddomain、HotDogfoldlikedomain和hydrophobicchanneldomain这些PDS蛋白的典型结构域，命名为RgPDS1。利用基因组文库比对组装，对gap区域设计特异引物扩增并测序，最终获得了7667bp的RgPDS1基因组序列。RgPDS1的基因组序列包含14个内含予，15个外显子。cDNA和基因组DNA序列分别提交在NCBI，注册号分别为MW132596和MW132597。利用qRT-PCR分析了RgPDS1的表达模式，发现RgPDS1在地黄不同部位(组织)均具有表达，在叶和花中的表达量相对较高。在RgPDS1的第4外显子上设计靶序列，克隆到载体pKSE401上。利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法，获得11个白化苗株系。11株白化苗中，6株苗呈完全白化，5株苗呈不同程度白化，属于嵌合体和杂色。取其中8株进行突变位点检测，测序结果表明，8株白化苗的靶点序列均出现不同程度的变异，证明白化表型是由于碱基变化造成的。株系5白化苗叶片中的叶绿素a、叶绿素b和总类胡萝卜素均显著低于野生型，块根中的类胡萝卜素含量仅有野生型块根的1.83％。建立的高效基因编辑体系为进一步研究WRKY基因在地黄毛蕊花糖苷生物合成中的分子功能奠定基础。
4.RgWRKY37基因编辑载体的构建和遗传转化。用地黄基因组DNA为模板进行PCR扩增并测序，获得长度为1597bp的RgWRKY37的基因组序列，分析表明RgWRKY37基因包含2个内含子。在第一个外显子上靠近ATG的位置设计一个sgRNA靶点序列，克隆到载体pKSE401上，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法进行地黄叶片转化，共获得抗性愈伤89个，分化出160株再生苗，其中77株具有良好的卡那霉素抗性。对株系进行阳性鉴定后，取15株阳性株系的地黄块根进行总苯乙醇苷和毛蕊花糖苷含量测定，发现所有检测株系的块根中毛蕊花糖苷含量均显著低于对照，10个株系(2/3)的总苯乙醇苷含量显著低于野生型对照。选择其中6个株系利用T克隆检测靶位点的序列变异情况，发现这6个株系在靶位点均存在碱基突变。说明RgWRKY37基因发生突变后，造成蛋白质功能的改变或丧失，进而导致地黄块根中苯乙醇苷和毛蕊花糖苷生物合成受影响。证明CRISPR/Cas9系统有效的实现了对RgWRKY37的基因编辑，RgWRKY37是地黄毛蕊花糖苷生物合成的正向调控因子。