【摘 要】
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枸橼（Citrus medica）是柑橘属三大原始种质之一,具有丰富的种质资源和优良性状,其中枸橼C-05是柑橘属独特的抗柑橘溃疡病种质,克隆并验证抗病基因的功能对抗病育种至关重要,前期在枸橼C-05茎段进行组织培养和候选关键基因的遗传转化实验中,观察到茎段外部在充分消毒的情况下,茎段切口区域仍易生长多种微生物。初步对分离的菌进行分子鉴定,序列分析结果显示为内生菌,且不同的内生菌对培养基的pH敏感
【基金项目】
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国家自然科学基金-国际（地区）合作与交流项目“抗溃疡病柑橘种质的抗性遗传学评价及分子鉴定”（31720103915）； 国家重点研发计划“果树抗性机制与调控”（2018YFD1000306）； 湖南创新型省份建设专项经费资助（2019RS1052）；
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枸橼（Citrus medica）是柑橘属三大原始种质之一,具有丰富的种质资源和优良性状,其中枸橼C-05是柑橘属独特的抗柑橘溃疡病种质,克隆并验证抗病基因的功能对抗病育种至关重要,前期在枸橼C-05茎段进行组织培养和候选关键基因的遗传转化实验中,观察到茎段外部在充分消毒的情况下,茎段切口区域仍易生长多种微生物。初步对分离的菌进行分子鉴定,序列分析结果显示为内生菌,且不同的内生菌对培养基的pH敏感性有差异。因此,本研究拟分离和鉴定枸橼C-05及其它12份枸橼种质的内生菌,通过对内生菌形态特征和培养基pH敏感性评价,为后期探索枸橼茎段组织培养和遗传转化的最优条件打下基础。内生菌的分离和鉴定取得的主要结果如下:1.选择培养室生长的枸橼半木质化茎段,采用75%的乙醇和1%的次氯酸钠进行表面消毒,将茎段、表皮与皮层组织及中柱组织分别放置于牛肉膏培养基、高氏一号培养基、PDA培养基和MT培养基上,28℃,暗培养7-30 d,对生长的菌进行分离和鉴定,从11种不同枸橼种质中共分离获得134株微生物,鉴定到46株内生菌株,其中18株内生细菌,16株内生放线菌,12株内生真菌,而丹娜香橼、园香橼尚未分离出内生菌。通过分类分析已鉴定的46株内生菌,可分为14个门或属,分别是子囊菌门（Ascomycota）、曲霉菌属（Aspergillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、短小杆菌属（Curtobacterium.）、两面神均属（Janibacter）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、微杆菌属（Microbacterium）、泛菌属（Pantoea）、青霉属（Penicillium）、叶点霉菌属（Phyllosticta）、假单胞杆菌属（Pseudomonas）、根瘤菌属（Rhizobium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和链霉菌属（Streptomyces）。其中已鉴定的内生菌中属于短小杆菌属（23.91%）、芽孢杆菌属（13.04%）、青霉属（13.04%）和假单胞杆菌属（10.87%）的比例较高。2.对表皮和皮层组织的混样及中柱组织研磨培养,在表皮和皮层组织中,鉴定到4株内生细菌、2株内生放线菌和8株内生真菌;在中柱组织中鉴定到1株内生细菌和4株内生放线菌,其余均通过茎段分离到。3.内生菌在不同pH培养基的敏感性实验,结果显示内生细菌和放线菌在pH 4时生长受抑制明显,且最适pH在6-8之间。属于内生细菌的杨凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense）在pH 9的LB培养基上生长最缓慢;分散泛菌（Pantoea dispersa）在pH4的LB培养基上生长抑制不明显。在内生放线菌中,1株在pH 9的LB培养基上生长最缓慢,5株内生放线菌在pH 4的培养基上生长缓慢,但均属于短小杆菌属。
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