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目的1.对小涎腺组织分别进行间充质干细胞方向培养和上皮祖细胞方向培养；在先前研究的基础上进一步深入鉴定小涎腺两种类型干细胞表型；对两种细胞的生物学特性如生长曲线、倍增时间、克隆形成率等进行检测,分析其干细胞增殖潜能；选用2D平面培养和3D matrigel培养两种诱导方案,对两种类型细胞分别进行2D及3D成肝诱导分化实验,探索小涎腺间充质干细胞(Minor Salivary Gland-derived Mesenchymal Stem Cells, MSG-MSCs)及上皮祖细胞(Minor Salivary Gland-derived Epithelial Progenitor Cells, MSG-EpiPCs)体外成肝诱导方法,分析确定其成肝分化潜能。2.建立小鼠2/3肝大部分切除损伤模型,设立对照组；对小涎腺间充质干细胞和上皮祖细胞进行CM-Dil荧光标记示踪；分别移植小涎腺间充质干细胞及上皮祖细胞到小鼠肝损伤模型,评估移植细胞在肝损伤模型中的分布及转化,探讨这两种类型细胞在体内成肝的可能性。方法1.对小涎腺组织进行免疫荧光鉴定,分析从小涎腺组织中获得干细胞的可能性；通过组织块培养法从人小涎腺组织中培养间充质干细胞及上皮祖细胞,进行纯化扩增；利用免疫荧光、流式细胞仪等对获得的细胞进行表型鉴定；检测克隆形成率、生长曲线及倍增时间,对间充质干细胞进行成骨成软骨成脂分化诱导,研究两种细胞的生物学特性。QPCR检测干细胞及成肝相关基因的表达情况,并与骨髓间充质干细胞进行比较,深入探讨细胞的干细胞特征及成肝分化的可能性。2.分别对两种细胞进行体外2D及3D成肝分化诱导,观察细胞生长及形态的变化,通过免疫荧光、吲哚青绿ICG摄取及QPCR检测不同诱导条件下的成肝分化情况。3.对小涎腺间充质干细胞和上皮祖细胞进行CM-Dil荧光标记；建立小鼠2/3肝大部分切除模型,随机分为3组：MSG-MSCs组移植小涎腺间充质干细胞(n=15,其中有3只做流式分析用),MSG-EpiPCs组移植小涎腺上皮祖细胞(n=12),及正常对照组(n=3)；细胞通过尾静脉注射移植到小鼠体内,移植后1周、2周、3周、4周分别取材；荧光显微镜及流式细胞仪分析移植2周后细胞在小鼠体内的分布,观察移植细胞的归巢情况；并将细胞移植后肝组织消化进行再培养,评估细胞移植后的活力；对取材组织进行免疫荧光鉴定,观察成肝相关标记蛋白的表达。结果1.小涎腺组织表达白蛋白(Albumin, ALB)、甲胎蛋白(a-Fetoprotein, AFP)、细胞角蛋白(Cytokeratin) CK15、CK18及CK19、富含亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体(Leucine-rich repeat-containing G Protein-coupled Receptor, LGR) LGR5及LGR6；分离获得的间充质干细胞及上皮祖细胞生长良好,体外传代均可达25次。免疫荧光及流式分析表明,小涎腺间充质干细胞表达谱与公认的骨髓间充质干细胞表型相似,上皮祖细胞表达细胞角蛋白、ATP结合盒转运蛋白G2(ATP-binding cassette superfamily G member2, ABCG2)、胎盘表达转录本-1(Placenta-expressed Transcript-1, PLET-1)等上皮祖细胞标记,两种细胞均表达LGR5和LGR6,其中部分间充质干细胞特异性表达阶段特异性胚胎抗原1(stage-specific embryonic antigen-1, SSEA-1)(27.63%±1.88%),上皮祖细胞特异性表达转录因子性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box2,SOX2)(19.2%±8.94%)。P5代间充质干细胞和上皮祖细胞的倍增时间分别为19.77小时和24.93小时,克隆形成率分别为41%±5.4%和10.7%±3.0%。间充质干细胞可成功向成骨、成软骨、成脂方向分化。QPCR检测显示与骨髓间充质干细胞相比,小涎腺间充质干细胞高表达LGR5,上皮祖细胞高表达LGR6。2.两种细胞在2D及3D诱导情况下均可向肝细胞样细胞分化,其中间充质干细胞在2D诱导情况下效果较好,而上皮祖细胞在3D诱导优于2D诱导。ICG摄取阳性。免疫荧光和QPCR结果显示二者在诱导后均能表达肝细胞相关蛋白。3.小涎腺间充质干细胞移植2周后,在小鼠肝、脾、胸腺、心、肺、胰腺、肾、皮肤中均可观察到CM-Dil红色荧光信号,其中肝脏组织中最多,肺和脾脏次之。间充质干细胞移植2周后肝组织再培养后多数贴壁细胞为CM-Dil阳性细胞,免疫荧光显示表达LGR5。对不同时间取材的肝组织切片免疫荧光染色显示小涎腺间充质干细胞及上皮祖细胞均可在体内表达肝细胞相关标记,部分上皮祖细胞位于胆管上皮间且CK19阳性。结论1.人小涎腺可成功获得间充质干细胞和上皮祖细胞两种类型的干／祖细胞。两种细胞均具有较强的自我更新能力,表达相关干细胞标记；两种细胞均表达LGR5和LGR6,其中间充质干细胞高表达LGR5,上皮祖细胞高表达LGR6,这是在涎腺中首次发现参与Wnt信号调控的干细胞。2.小涎腺间充质干细胞及上皮祖细胞在体外2D及3D成肝分化诱导下均可成功分化为肝细胞样细胞,表达肝细胞相关蛋白。3.在小鼠肝大部分切除模型中,小涎腺间充质干细胞及上皮祖细胞向损伤肝脏聚集,并表达肝细胞标记蛋白,参与到肝细胞再生过程中。其中上皮祖细胞还可参与到胆管再生中,表达胆管上皮标记CK19。