论文部分内容阅读
肝细胞癌是原发性肝癌的主要类型，它的发病率及死亡率都很高，因此，对肝细胞癌的基础和临床研究以及探索更有效的诊断治疗方法显得尤为重要。单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用，同时也在肿瘤基础研究、临床诊断和治疗中得到了广泛应用。本研究制备了两株抗肝特异表达蛋白LFIRE-1/HFREP-1单克隆抗体，目的是为肝特异表达蛋白LFIRE-1/HFREP-1的功能研究提供实验用检测工具，其研究过程及结果如下： 利用原核表达的LFIRE-1/HFREP-1蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，经三次免疫后，分离血清，并建立间接ELISA检测方法为接下来的杂交瘤细筛选作准备。结果显示，最适抗原包被浓度为11靏／ml，血清最适稀释度为1:6400. BALB/c小鼠经LFIRE-1/HFREP-1抗原第四次免疫３天后，取脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞以9:1比例进行融合，PEG4000作融合剂，融合率为94:1%。间接ELISA方法筛选显示，阳性率为89%。应用有限稀释法3次亚克隆并以Westernblot进一步验证，最终筛选得到两株特异分泌LFIRE-I/HFREP-I抗体的杂交瘤细胞株，分别定名为LF307-1LF560-4.杂交瘤细胞株腹腔注射小鼠，体内诱生腹水，腹水单抗通过Protein G-argarose柱纯化。利用SDS-PAGE、ELISA等检测方法对所获单抗进行特性鉴定，结果表明：两株单抗LF307-1、LF560-4的分子量为156.4Kda:亚类分别为:Igg2a(K)、IgG1(K);腹水单抗效价均达1×107,LF307-1单抗的相对亲和力大于LF560-4.单抗的相对亲和力。 单克隆抗体进行初步检测应用：利用单抗检测LFIRE-I/HFREP-1蛋白在人正常肝、肝肿细胞株和其它肿瘤细胞株中表达情况，结果显示：LFIRE-I/HFREP-1蛋白在人正常肝中特异表达，在肝癌细胞株和其它肿瘤细胞株中表达下调或不表达。检测LFIRE-1/HFREP-1同源基因MFREP-1的蛋白在小鼠脏器中表达情况，结果显示：MFREP-1蛋白在小鼠肝组织中特异表达，其它脏器中不表达。最后，为了确定LFIRE-1/HFREP-1蛋白定位于所表达细胞何处．作者通过细胞免疫荧光法对LFIRE-1/HFREP-1蛋白进行了细胞内定位检测，结果显示：LFIRE-I/HFREP-I蛋白定位于表达细胞的细胞质中。 抗肝特异表达蛋白LFIRE-I/HFREP-1单克隆抗体的成功制备及初步应用为LFIRE-I/HFREP-1的进一步功能研究提供了很好的实验手段和检测工具。