研究背景肝癌分为原发性肝癌和转移性肝癌,是一种高致病性、高致死率的恶行肿瘤,在全球恶性肿瘤发病率排名中位列前五位,并且呈现上升趋势。肝癌病因有很多,包括饮酒过量、环境污染、食品变质以及防控机制不足等,这些都有可能引起肝癌的发生。其中,由HBV或HCV病毒引起的慢性肝炎,以及饮酒过量所导致的酒精性肝硬化是进一步导致肝癌发生的主要诱因。目前,针对肝癌的治疗有很多种方法,包括化学疗法、放射性疗法、肝脏切除以及细胞因子治疗等,但因其对病人免疫系统的破坏及其所带来的强烈的毒副反应,使得肝癌治愈效果不理想。因此,急需寻找一种安全、高效的肝癌治疗方法和策略。随着近年来医学的不断发展,肿瘤生物治疗逐渐引起人们的重视。IL-12作为免疫应答调控中重要的细胞因子,可以通过与受体结合,对T细胞、NK细胞等免疫细胞产生活化作用,促进IFN-γ、TNF-α、IL-10等细胞因子的分泌,抑制肿瘤细胞的生长。但是,由于系统性应用IL-12治疗肿瘤可产生强烈的毒副作用,目前IL-12仅通过局部给药的方法应用于黑色素瘤、肾细胞腺癌等肿瘤疾病的治疗。奥沙利铂(乐沙定,Oxaliplatin)作为一种新的铂类抗癌药,目前已被批准用于临床直肠癌的治疗。2013年有国家食品药品监督管理局批准用于“不适合手术切除或局部治疗的局部晚期和转移的肝细胞癌(HCC)的治疗”,为全球首个获批的用于肝癌系统化疗的药物。但是,由于其可产生比较严重的骨髓抑制、肠胃道反应和肝脏损伤,因此需要同时应用可提升免疫、恢复骨髓的造血功能的辅助药物,减少副作用,增强药物治疗效果。因此,本文将免疫系统中重要的细胞因子IL-12与已奥沙利铂联合使用,以期提升对肝癌的治疗效果。另外,由于部分肝癌的发生是由肝硬化所导致的,而肝脏纤维化又是肝硬化的前期表型,因此,寻找有效治疗肝纤维化的药物对于预防肝癌的发生意义重大。但是,目前临床用肝纤维化治疗药物周期长并伴有多种副作用,而新药研发耗时长、成本高,从临床常用药物中寻找和挖掘安全、高效的纤维化治疗药物是一重要途径。法舒地尔作为RhoA激酶抑制剂,临床主要应用于改善脑组织微循环,促进神经再生。但有研究报道在临床用药中其对肝损伤也有一定的修复作用。众所周知,免疫系统在肝纤维化发生发展过中发挥重要的作用,因此,我们想探究法舒地尔用于治疗肝脏纤维的可行性,及其对免疫系统的影响和作用机制,从而发掘一种可以有效抑制肝脏纤维化、预防肝癌发生的药物。研究目的1.研究IL-12表达载体联合奥沙利铂抗HCC的作用,并阐述其抗肿瘤免疫机制。2.评价法舒地尔治疗肝纤维化的可行性,并研究法舒地尔治疗肝纤维化的作用机制。一、IL-12联合奥沙利铂治疗HCC的作用及机制研究方法1.应用重组mIL-12表达载体对小鼠Hepa1-6肝癌细胞系进行转染,设置Ctrl组、pSecTag 空载体组、mIL-12 过表达(mIL-12-over)组,利用 PCR、ELISA的方法,分别对mIL-12 mRNA和蛋白水平进行检测,观察mIL-12表达载体在Hepa1-6细胞的转染效率。2.利用PCR和流式细胞术方法检测IL-12受体在HCC细胞上的表达水平。3.对Hepa1-6细胞进行AnnexinV/PI染色,利用流式细胞术的方法检测mIL-12过表达后对HCC细胞凋亡的影响;利用PCR的方法检测mIL-12过表达对Hepa1-6细胞增殖相关基因Ki67的表达水平。4.利用Transwell的方法检测mIL-12过表达后对HCC细胞迁移、侵袭的影响。5.利用Transwell的方法检测mIL-12过表达的HCC转染上清对脾脏淋巴细胞迁移的影响,并利用流式细胞术的方法检测其对不同免疫细胞亚群比例、活化水平的影响。6.利用PCR、ELISA的方法,检测mIL-12过表达对Hepa1-6细胞TGF-β基因水平和蛋白水平的影响。7.Western Blot方法检测mIL-12过表达后,HCC细胞内信号通路的变化,mIL-12过表达肿瘤细胞上清对脾单个核细胞中STAT1信号通路的影响。8.流式细胞术检测经mIL-12过表达HCC细胞上清孵育后,脾脏不同免疫细胞亚群STAT1信号通路的影响,以及脾脏中CD8+T细胞分泌IFN-γ、TNF-a的水平。9.流式细胞术检测mIL-12过表达对HCC细胞PD-1/PD-L1表达水平的影响10.mIL-12过表达HCC细胞上清孵育脾细胞24小时,CFSE标记的Hepa1-6细胞为靶细胞,在12孔板中设置不同效靶比,利用细胞实时监测仪检测脾细胞不同处理组对HCC细胞的杀伤效率。11.利用Hepa1-6细胞于C57BL/6J小鼠进行腋下荷瘤,制备小鼠荷瘤模型。荷瘤一周后对小鼠进行治疗,分别设置空白对照组、单独使用mIL-12载体组、单独使用奥沙利铂组以及mIL-12载体与奥沙利铂联合使用组。其中,mIL-12质粒瘤内注射,每隔两天一次,每次15μg;奥沙利铂腹腔注射,每隔两天一次,每次1.5mg。治疗期间测量肿瘤体积,以观察不同处理组肿瘤生长速率。12.治疗三周后将小鼠处死,称量瘤重,并对瘤块拍照。利用流式细胞术的方法分别对肝脏、脾脏以及肿瘤内部不同免疫细胞亚群以及细胞因子变化进行检测。观察不同处理组对免疫细胞的影响。研究结果1.IL-12可成功转入HCC细胞并可稳定表达PCR和ELISA的结果显示,将mIL-12过表达载体转入小鼠HCC细胞系Hepa1-6细胞后,无论是在基因水平还是蛋白水平皆可检测到mIL-12的稳定表达。2.HCC细胞表达IL-12受体并且IL-12可对肿瘤细胞凋亡、增殖产生直接作用通过Real-time PCR以及流式细胞术的方法检测到IL-12受体可在肿瘤细胞上表达。利用流式细胞术的方法发现,当转入IL-12质粒后,HCC细胞凋亡率上升,并且其增殖相关基因Ki67表达下调,说明IL-12促进HCC细胞凋亡、抑制其增殖。3.IL-12可抑制HCC细胞迁移、侵袭,抑制TGF-β的表达通过Transwell的方法发现,与空白对照组和空载体组相比,mIL-12过表达组可抑制HCC细胞Hepa1-6的迁移和侵袭。并且,通过Real-timePCR和ELISA的方法发现,mIL-12过表达对Hepa1-6细胞TGF-β的表达产生的抑制作用。4.HCC过表达IL-12可趋化脾的单个核细胞并活化CD8+T细胞通过Transwell法发现,含有IL-12的HCC细胞转染上清可有效促进脾的单个核细胞的迁移。利用流式细胞术以及Western Blot检测发现,IL-12促进了脾细胞中T细胞STAT1信号通路。流式细胞术检测其不同细胞亚群的变化以及细胞因子的变化发现,IL-12可有效促进CD8+T细胞的活化,并促进其IFN-γ、TNF-α的产生。5.IL-12可抑制HCC细胞PD-L1的表达利用流式细胞术的方法检测发现,当mIL-12载体转染24小时后,HCC细胞表达PD-L1的水平显著下调。6.IL-12可以提高脾单个核细胞对肿瘤细胞的杀伤能力将不同处理的肿瘤细胞上清体外孵育小鼠脾单个核细胞24小时,设置2.5:1、5:1、10:1三个不同效靶比,用细胞检测仪观察杀伤过程发现,与空白对照和空载体组相比,IL-12过表达组杀伤效率显著上升,说明IL-12提高了脾细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。7.mIL-12与奥沙利铂联合治疗可有效抑制HCC在小鼠体内的生长速率通过对荷瘤鼠进行治疗发现,mIL-12与奥沙利铂联治疗组可有效抑制肿瘤生长速率,最终肿瘤体积与其它组相比较也显著下降。8.IL-12与奥沙利铂联合使用可有效促进免疫细胞的活化通过流式细胞术对治疗后小鼠脾脏、肝脏以及肿瘤内部免疫细胞亚群进行检测分析发现,mIL-12与奥沙利铂联用可以促进肿瘤组织中CD4+T、CD8+T细胞CD69的表达,并且可以上调NKT的比例;同时,联合治疗组脾脏中CD4+T和NK细胞活化比例也显著上调。三个不同治疗组与空白对照组相比,脾脏中CD8+T比例均有所上调,单独治疗可引起NKT细胞比例上调,但联合治疗组对NKT细胞作用不明显。在肝脏中,联合治疗组对CD4+T、CD8+T和NK细胞皆有促进活化的作用。另外,联合治疗可有效活化肿瘤浸润的巨噬细胞。二、法舒地尔治疗小鼠肝纤维化及其机制研究研究方法1.利用TAA对小鼠进行造模,每隔两天一次,每次20mg;TAA注射一周后,注射法舒地尔(10mg/kg),每天一次,连续三周,同时设置TAA模型对照组和未注射TAA的健康鼠组。2。将小鼠处死后,称量其体重以及肝脏、脾脏重量,计算肝、脾比重。对肝、脾拍照,观察不同处理组间肝脏纤维化程度。3.利用HE染色法、AST/ALT检测不同处理组小鼠肝脏淋巴细胞聚集情况以及肝脏损伤情况。4.利用天狼猩红染色法检测不同处理组肝纤维化程度,利用Real-time PCR、Western Blot法检测与纤维化相关的Colla-1和α-SMA的表达水平。5.流式细胞术检测不同处理组间脾脏、肝脏中不同免疫细胞亚群的变化。6.体外加不同浓度法舒地尔孵育小鼠肝脏、脾脏单个核细胞24小时,流式细胞术检测其对不同免疫细胞亚群的影响。7.不同浓度法舒地尔孵育NK-92细胞24小时,WesternBlot法检测其对不同信号通路的影响。8.流式细胞术检测经不同浓度法舒地尔孵育的NK-92细胞系IIFN-γ的分泌水平。9.流式细胞术检测检测不同浓度法舒地尔对肝形状细胞系LX2细胞凋亡和周期影响。10.Real-time PCR法检测经不同浓度孵育后LX2细胞凋亡、增殖相关基因Bcl-2、Bax、Ki67的变化及其对RhoA基因的影响。11.Real-time PCR和Western Blot法检测不同浓度法舒地尔对肝星状细胞LX2中α-SMA基因以及蛋白水平表达的影响。12.Real-time PCR、ELISA法检测不同浓度法舒地尔对LX2细胞TGF-β基因和蛋白水平表达的影响。13.细胞检测仪检测不同浓度法舒地尔孵育后的人外周血NK细胞对LX2细胞系的杀伤效果。研究结果1.法舒地尔可对小鼠肝脏纤维化产生抑制作用通过对不同处理组的小鼠进行天狼猩红染色、检测纤维化相关蛋白colla-1、α-SMA的表达发现,法舒地尔可降低肝纤维化程度。2.法舒地尔可降低肝脏炎症通过对不同治疗组小鼠肝脏进行HE染色以及检测小鼠外周血中ALT、AST的表达量发现,法舒地尔可有效降低由肝损伤所引发的炎症反应。3.法舒地尔可以促进肝脏、脾脏中CD4+T细胞和NK细胞的活化通过对治疗后肝脏和脾脏中不同免疫细胞亚群进行流式检测发现,法舒地尔可有效促进肝脏、脾脏内CD4+T细胞和NK细胞CD69的表达,说明法舒地尔可促进CD4+T细胞和NK细胞的活化。通过用不同浓度法舒地尔体外刺激肝脾单个核细胞发现,法舒地尔可以促进CD69+NK细胞比例,同时也可对NK细胞受体NKG2A、NKG2D表达产生影响。4.法舒地尔可以活化NK-92细胞ERK信号通路,促进IFN-γ的表达经不同浓度法舒地尔孵育NK-92细胞,用Western Blot法检测其对不同信号通路的影响,发现法舒地尔可以活化NK-92细胞中ERK/P-ERK信号通路,Real-timePCR以及流式检测发现法舒地尔促进了 NK-92细胞中IFN-γ的表达。5.法舒地尔可以促进LX2细胞的凋亡,影响其周期通过Real-time PCR以及流式检测发现,不同浓度法舒地尔可有效下调LX2细胞中抗凋亡基因Bcl-2的表达,上调促凋亡基因Bax的表达以及与其表达相关的ERK信号通路。并且,随着法舒地尔浓度的增加,LX2细胞凋亡率增加。通过周期检测发现,法舒地尔将LX2的分裂阻滞在了 G1期。6.法舒地尔可抑制LX2细胞系中RhoA的表达PCR检测不同浓度法舒地尔孵育LX2细胞后RhoA基因表达水平显著下调,并且α-SMA蛋白水平表达下调。同时,检测到LX2细胞TGF-β表达得到抑制。7.法舒地尔可提高人外周血中NK细胞对LX2细胞的杀伤功能将人外周血中NK细胞分选出,体外加不同浓度法舒地尔孵育后,其对LX2细胞的杀伤率增加。结论通过本文研究发现,IL-12过表达载体转入HCC细胞后可诱导HCC自身产生凋亡、增殖抑制的影响,并且下调免疫抑制性分子PD-LI、TGF-β在HCC中的表达,抑制HCC迁移和侵袭能力。IL-12过表达HCC细胞上清体外对肝脾单个核细胞具有显著的募集效果,其中对CD8+T细胞产生明显的活化作用,并且可以促进其IFN-γ、TNF-α的表达;同时,IL-12过表达HCC细胞上清可以提高淋巴细胞对HCC的杀伤能力。进一步我们利用荷瘤小鼠模型,探讨IL-12载体与奥沙利铂联合治疗HCC的效应。我们发现,联合治疗可以很好的抑制肿瘤生长,活化肝脏、脾脏和肿瘤组织中淋巴细胞。该部分研究说明,IL-12既可以对HCC细胞产生直接的抑制效果,同时可以活化免疫细胞,促进抗肿瘤免疫应答。为了更好的对肝癌进行预防,我们探讨了临床用药法舒地尔用于抗肝纤维化的效应和相应机制。我们发现,法舒地尔可以有效改善肝纤维程度,抑制肝癌进程。通过体外实验证明,法舒地尔可以有效促进肝星状细胞的凋亡,抑制其免疫抑制分子TGF-β的分泌,并且可以通过抑制RhoA的表达从而降低α-SMA的产生。通过体内、体外研究发现,法舒地尔可以通过活化肝脏内NK细胞,促进其IFN-γ的分泌来对肝星状细胞产生杀伤作用,对肝纤维化的发生具有良好的抑制作用。综上所述,IL-12与奥沙利铂联合治疗肿瘤疾病可以通过对不同免疫细胞的活化得到很好的治疗效果,为临床治疗肿瘤疾病提供新的治疗方案。另外,法舒地尔可以通过抑制肝纤维化的发生来组织肝癌进程,从而对肝癌起到一定的预防作用。