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目的：炎症信号和脂质信号与胰岛素抵抗密切相关,但是二者的相互作用及其机制众说纷纭。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是血浆中重要的炎症信号分子,棕榈酸(Palmitic acid, PA)是人体内含量最多的中长链饱和脂肪酸。本课题以TNF-α和PA为炎症和脂质信号的代表,研究TNF-α能否通过改变微血管对PA的穿胞(Transcytosis)转运,加强PA促心肌细胞胰岛素抵抗的作用,并对自噬和核转录因子-κB (Nuclear factor-κB, NF-κB)信号在该过程中的相互作用进行探讨。方法：(1)成年大鼠心肌微血管内皮细胞(Cardiac microvascular endothelial cells, CMECs)培养接种在Transwell上层小室中,将饱和脂肪酸的荧光类似物,C1-BODIPY-C12 (BODIPY-PA)与白蛋白(Albumin)的复合物加入上层小室,通过竞争抑制的方法建立检测脂肪酸穿胞转运模型。(2)在蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)、NF-κB、自噬信号通路的抑制剂存在与否的情况下,利用此模型检测TNF-α对脂肪酸跨内皮细胞穿胞的影响。(3)使用转录因子活性测定、western blot、GFP-LC3过表达等方法检测内皮细胞中PKC转位、NF-κB活性及自噬相关蛋白表达的变化。(4) CMECs和原代成年大鼠心肌细胞共培养模型中,对小室上层的CMECs给予TNF-α及各信号抑制剂处理后,在小室上层加入PA,使PA跨过内皮细胞转运到小室下层,刺激小室下层的心肌细胞。然后,检测心肌细胞在胰岛素作用下对2-NBDG的摄取。(5)在动物实验中,对C57BL/6J小鼠分别给予TNF-α、PA、NF-κB抑制剂Pyrrolidinedithiocarbamic acid (PDTC)或自噬抑制剂3-Methyladenine (3MA)处理后,使用小动物正电子发射断层扫描(Positive emission tomography, PET)检测胰岛素刺激下心脏的I8F-FDG摄取量,计算百分注射剂量率(%ID/cc)。处死小鼠后收集组织样本,使用γ计数仪直接测定心脏放射值,并通过western blot方法检测心脏内胰岛素下游信号的变化、通过免疫组化检测心脏内脂肪酸转运蛋白4(Fatty acid transport protein 4, FATP4)的表达及分布。结果：(1)我们利用荧光标记的饱和脂肪酸类似物BODIPY-PA,在原代培养的CMECs建立了一个可连续观察6小时的体外脂肪酸穿胞模型。在此模型中,我们观察到BODIPY-PA经CMECs的穿胞表现为时间依赖性和浓度依赖性,可被PA抑制。由BODIPY-PA的“荧光值-浓度”标准曲线计算可得各浓度下BODIPY-PA的总转运量和穿胞量。我们选取穿胞量占总转运量比例较大,曲线平滑性较好的BODIPY-PA 40 μM组进行实验。(2)利用体外穿胞模型可观察到TNF-α增加脂肪酸跨CMECs的穿胞,通过siRNA干扰发现此作用依赖于FATP4的表达。自噬抑制剂3MA或NF-κB结合序列寡核苷酸片段(Oligodeoxynucleotide, ODN)都可以抑制TNF-α增加FATP4表达以及促脂肪酸穿胞的作用。(3)TNF-α可以上调NF-κB的转录活性,同时激活自噬,增加LC3-Ⅱ的表达、增加LC3自噬小体含量、增加Beclinl的表达。NF-κB ODN可以抑制TNF-α引起的LC3-Ⅱ表达增加、Beclinl表达增加以及LC3自噬小体增多。反之,3MA也可以抑制TNF-α对NF-κB的激活。通过分离胞膜蛋白发现TNF-α促进PKCδ从细胞浆转位到细胞膜,PKCδ siRNA可以阻断TNF-α促脂肪酸穿胞及激活NF-κB和自噬的作用。(4)PA单独孵育心肌细胞,可呈浓度依赖性地减弱胰岛素对Akt和GSK3β的磷酸化,减少胰岛素刺激下心肌细胞对2-NBDG的摄取。在体外CMECs-心肌细胞共培养实验中,跨内皮细胞转运到小室下层的PA减少了胰岛素刺激下心肌细胞对2-NBDG的摄取；TNF-α孵育CMECs加强了PA对心肌细胞胰岛素信号的损伤作用,而TNF-α的这种加强作用可以被3MA或PDTC抑制。(5)小动物PET结果显示,给予PA的小鼠在胰岛素刺激下表现出较少的心脏18F-FDG摄取,TNF-α注射进一步加重了PA引起的摄取减少,而TNF-α的作用可以被3MA或PDTC注射阻断。心脏γ计数检测结果与PET扫描结果一致。Western blot对胰岛素信号相关蛋白的检测结果显示,在胰岛素刺激下,相比于TNF-α和PA单独处理的小鼠,TNF-α+PA联合处理组小鼠心脏表现出更低的Akt和GSK3β磷酸化水平,3MA或PDTC可改善TNF-α+PA联合处理引起的心脏胰岛素抵抗。免疫组化结果显示TNF-α处理的小鼠心脏微血管中FATP4表达上调,而3MA或PDTC处理可以减少此上调效应。结论：TNF-α通过激活心脏微血管内皮细胞自噬和NF-κB信号,二者互相加强,共同促进PA在CMECs的穿胞转运,进而加重PA所引起的心肌细胞胰岛素抵抗。