家蚕Bme细胞自噬与凋亡关系初步研究

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近年,细胞自噬与细胞凋亡关系的研究进展备受关注,因为它涉及到生物的发育,联系着一些疾病的发生,演绎着生命的维系与延续等。有关哺乳动物细胞,特别是癌细胞自噬与凋亡相互关系的研究已经取得了许多重要的进展,二者的关系比较复杂,因细胞类型、诱导因子或细胞的状态等因素不同,或相互促进、相互拮抗,相互独立。目前有关昆虫细胞自噬与细胞凋亡关系的报道尚少,需要深入开展此方面的研究。本文以离体培养的家蚕细胞Bme为材料,采用多种不同的方法进行诱导,提高家蚕细胞Bme的自噬水平,通过荧光定性定量分析,电子显微镜技术,流式细胞术,酶学分析和琼脂糖凝胶电泳等技术,研究了离体培养的家蚕细胞高水平自噬作用对细胞凋亡的影响。结果表明:雷帕霉素处理和氨基酸饥饿都能诱导家蚕细胞Bme内MDC染色阳性小泡(自噬泡和自噬溶酶体)数量增多和体积增大;电镜观察表明雷帕霉素处理4h后,细胞内的线粒体数量减少,体积膨大,自噬泡数量增多。初步的定量分析表明经饥饿后,4h时发生高水平自噬作用的细胞从对照组6.1%上升至了15.9%,8h时发生高水平自噬作用的细胞下降至12.4%。诱导早期细胞内caspase-3的活性较低,但是后期细胞内caspase-3的活性显著升高,在12h时caspase-3的活性是对照组细胞的近10倍。同时,两种自噬诱导方法处理的细胞经AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测发现细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻,细胞的凋亡率显著增加。雷帕霉素处理12h的早期凋亡细胞率从5%提高到24%,氨基酸饥饿处理12h的早期细胞凋亡率从5%提高到16%。光学显微镜下可明显看到形成的凋亡小体,经DAPI染色可以看到染色质凝集和碎裂。琼脂糖凝胶电泳检测发现DNA片段化,出现梯形条带。采用3甲基腺嘌呤抑制细胞自噬可以显著降低饥饿细胞的凋亡率,但细胞坏死的比例却有所增加。同时还表明,抑制家蚕细胞Bme基础水平的自噬作用,也不利于细胞生存。以上结果表明,在一定条件下家蚕细胞的诱导性高水平自噬作用先于细胞凋亡或至少同时发生,并且高水平自噬能促进细胞的凋亡;家蚕细胞基础水平的自噬作用有利于细胞的生存。今后的工作将是研究昆虫细胞高水平自噬活动与细胞凋亡之间互串的分子机制。
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