研究目的：了解三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)对顺铂抗肿瘤作用和细胞缝隙连接(gap junction, GJ)功能的影响；以及 PNS对顺铂细胞毒性的影响是否是通过改变GJ功能产生的。　　实验方法：　　1.转染并表达含Cx32/26的HeLa细胞的培养、筛选及诱导：本实验室构建了能够表达异质性 Cx32/Cx26通道的载体质粒（PBI- Cx32T/Cx26）。这种双向质粒可以在一个启动子的控制下同时表达 Cx32和 Cx26。Cx的表达是可以控制的，一般情况下，Cx不表达；需要表达时，在培养基中加入Doxycycline引起Cx表达。这样，能够避免因过度表达Cx引起的细胞伤害。本研究采用转染并稳定表达Cx32/Cx26的HeLa细胞。　　2.标准细胞集落形成分析法(standard colony-forming assay)分析顺铂细胞毒性：本研究采用 Dr.Glazer报道的“标准细胞集落形成分析法”，测定顺铂对培养细胞（稳定表达Cx32/26的HeLa细胞）的细胞集落（克隆）形成的影响。细胞集落形成反映了单个细胞增殖潜力，能较灵敏地测定抗癌药的活性。本实验以顺铂降低细胞集落形成率（Surviving Fraction）作为顺铂的细胞毒性指标。用不同密度接种细胞的方法获得有GJ形成（已融合）的细胞和无GJ(未融合)的细胞。在上述细胞，观察GJ形成对顺铂的细胞毒性影响。　　顺铂处理组的细胞集落数　　细胞集落形成率（Surviving Fraction）=未用顺铂处理组的细胞集落数　　为了避免不同生长期的细胞对顺铂敏感性的差异对实验结果的影响，细胞在加入顺铂前24小时用无血清培养基培养，使所有细胞均同步在G1期。　　3.“Parachute assay”测定细胞之间荧光染料传递—检测PNS对培养细胞GJ功能的影响：将表达有Cx32/26的HeLa细胞与荧光指示剂Calcein-AM和Dil-CM共同孵育，使Calcein-AM和Dil-CM进入细胞。培养4小时，待形成稳定的GJ后，　　用显微荧光系统观察，计数一个“供体细胞”周围含有Calcein的“接受细胞”作为GJ功能指标。　　实验结果：　　1.顺铂（0.1-1μg/ml）作用1小时，可浓度依赖性地降低表达 Cx32/26的HeLa细胞集落形成率。在有GJ形成的细胞（高密度接种，生长融合的细胞），顺铂的细胞毒性显著大于无GJ形成细胞（低密度接种，细胞生长未融合）。在有GJ的细胞，用GJ抑制剂2-APB(2.3μg/ml)可降低顺铂的细胞毒性；而GJ功能增强剂全反式维甲酸（all trans-retinoic acid,RA,3μg/ml）可显著增加顺铂的细胞毒性。但在无GJ形成的细胞，2-APB和RA对GJ功能无显著影响。结果证明GJ形成和增强GJ功能可增强顺铂的细胞毒性；抑制GJ功能可降低顺铂的细胞毒性。2.PNS能增强由 Cx32/26组成的GJ功能。“Parachute”荧光传递实验表明：PNS(200μg/ml)能增加表达Cx32/26的HeLa细胞之间的荧光传递，证明PNS能显著增强GJ功能；PNS（200μg/ml）的作用与RA(3μg/ml)相当。　　3.采用Dr.Glazer报道的“标准细胞集落形成分析法”，测定PNS对培养细胞（稳定表达Cx32/26的HeLa细胞）的细胞集落（克隆）形成的影响。研究结果发现，不管有无GJ形成的细胞，PNS（200μg/ml）对表达Cx32/26的HeLa细胞均有较弱的细胞毒性作用。　　4.PNS能增强顺铂的细胞毒性。在有GJ形成的细胞，PNS（200μg/ml）和顺铂联合使用，细胞集落形成率显著低于顺铂单用组；表明PNS能增强顺铂的细胞毒性。而在无GJ形成细胞，PNS对顺铂的细胞毒性无影响。在有GJ形成的细胞，PNS、2-APB和顺铂联合使用组的细胞集落形成率(0.44±0.04)显著高于顺铂与PNS联合用药组（0.17±0.04），证明2-APB能够抑制PNS增加顺铂的细胞毒性的作用。结果表明PNS可增强顺铂的细胞毒性；PNS对顺铂细胞毒性的影响是通过增加GJ功能产生的。　　实验结论：　　1.GJ形成和功能升高能够显著增强顺铂的细胞毒性；GJ功能减弱可降低顺铂的细胞毒性。　　2. PNS能增加Cx32/26组成的GJ功能。　　3. PNS可通过增加GJ功能而增强顺铂细胞毒性。