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近几年来,随着生物转化在合成高附加值有机物中优越性的体现,利用腈转化酶转化腈化合物生成相应的酸和酰胺的引起了广泛的关注,并且生物转化与传统的化学法具有反应条件温和,环境友好,转化率高,选择性好等优势,丙烯酸（酯）是用途广泛的大宗化学品,本论文以丙烯腈为底物,以筛选得到的微生物的腈水解酶作为催化剂,实现丙烯酸的生物法生产,本论文围绕产腈水解酶菌株的发现、表征、产酶条件优化、在合成丙烯酸中的应用、以及腈水解酶基因的克隆表达等环节展开了几方面的研究。首先通过分级筛选模型,以底物丙烯腈为唯一氮源进行富集筛选目标菌株,得到一株活力较高,稳定性较好的腈水解酶产生菌,从形态学、生理生化特性、16S rDNA及系统发育分析等几个方面进行鉴定。可确认该菌株为Arthrobacter nitroguajacolicus,拟命名为A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99。这是该种内首次报道的产腈水解酶的菌株。利用单因素和响应面优化确定了A.nitroguajacolicusZJUTB06-99较适发酵培养基成分为（%,w/v）:葡萄糖2.80,酵母浸膏0.57,己内酰胺0.42,K2HPO40.05,KH2PO4 0.05,MgSO40.05,谷氨酸钠0.075,经优化的培养基培养得到菌体,其酶活力是初始培养基培养菌体活力的2.86倍。考察了其它发酵条件对A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99产腈水解酶的影响,适宜的培养条件为:接种量3%（v/v）,摇瓶装液量15-20%（v/v）,初始pH 7.0,确认了发酵适宜时间为72-78 h。对静息细胞A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99转化丙烯腈生成丙烯酸的反应条件进行了优化研究。结果表明:最适宜的转化体系为pH为6.5磷酸盐缓冲液,最适反应温度40℃,且该酶在25-40℃范围内符合Arrhenius方程,测得表观活化能Ea=45.53 kJ/mol;A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99具有良好的热稳定性,在4℃、30℃和40℃下半衰期分别为218.6 h,157.6 h和129.8 h;10 mL反应体系中细胞量为0.2～0.3 g湿菌体较合适,细胞在165 min左右基本上能把0.3%（v/v）的底物丙烯腈完全转化,生成丙烯酸。底物特异性研究表明A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99只合成腈水解酶,并对一系列的腈化合物都有一定活性。一定浓度的底物和产物对细胞的活力均有抑制作用,当底物浓度超过0.7%（v/v）时,细胞活力受到一定程度的抑制,当在反应开始时体系中添加0.5%（v/v）产物丙烯酸,ZJUTB06-99腈水解酶活力完全被抑制。酶促反应动力学参数的研究发现,在底物浓度较低的情况下,测得Km为11.71 mmol/L,Vmax为0.26 mmol/（L·min）,在底物浓度较高存在抑制作用时,测得底物抑制常数Ks值为133.05 mmol/L。利用壳聚糖、海藻酸钠这两种包埋材料对静息细胞进行固定化,从固定化静息细胞的催化活性和颗粒的机械强度两方面出发,确定了壳聚糖固定化静息细胞的制备条件:壳聚糖2.0%（w/v）,三聚磷酸钠1.5%（w/v）,包埋菌体量5%（w/v）。海藻酸钠固定化静息细胞的制备条件:海藻酸钠1.5%（w/v）,CaCl2 3.0%（w/v）,菌体量4-6%（w/v）,颗粒直径2 mm,固定时间6 h。对固定化静息细胞的转化条件进行了研究,壳聚糖和海藻酸钠包埋的颗粒最适缓冲体系pH 6.2和7.4的磷酸盐缓冲液,与游离细胞相比发生了偏移。固定化细胞的最适反应温度为45℃,在此温度下,壳聚糖和海藻酸钠固定化细胞的半衰期分别为108.1 h,120.7 h,热稳定性较好。两种包埋载体的固定化静息细胞重复使用批次分别为8批和11批,并用ESEM电镜观察了重复使用前后颗粒表面微观结构的变化情况,静息细胞经固定化以后,对底物的耐受力有一定程度的提高,最大底物浓度从游离细胞的0.7%（v/v）上升到1.0%（v/v）。对海藻酸钠固定化颗粒PEI-GA强化,有利于改善海藻酸钠颗粒强度以及其抗磷酸盐的能力,强化参数确认为0.10%（v/v）PEI溶液中添加30 mM的CaCl2,30℃水浴摇床中和颗粒混合24 h后,再将颗粒用0.75%（v/v）GA处理30 s。强化后颗粒的重复使用批次达到了20次,较强化前的11批次,有明显改进,并进一步用ESEM电镜对颗粒强化前后表面微观形态变化进行了观察。细胞经超声波破碎固定化后,和静息细胞固定化相比,其对底物的转化速率有一定程度的提高。选择了壳聚糖和海藻酸钠两种载体对其固定化,确定了壳聚糖固定化细胞碎片的制备条件:壳聚糖2.5%（w/v）,三聚磷酸钠1.5%（w/v）,包埋菌体量5%（w/v）,固定时间较短,选择颗粒成形后马上用生理盐水洗净。确定了海藻酸钠固定化细胞碎片的制备条件:海藻酸钠1.5%（w/v）,CaCl2 3.0%（w/v）,菌体量5%（w/v）,颗粒直径2.1 mm左右。进一步对固定化细胞碎片的转化条件进行了研究,壳聚糖和海藻酸钠包埋时最适缓冲体系均为磷酸盐缓冲液,pH分别为6.2和7.4,并测定了其在酸性pH 4.0、碱性pH9.0以及最适反应pH值下的稳定性,固定化细胞碎片的最适反应温度为30℃,在此最适反应温度下海藻酸钠颗粒和壳聚糖颗粒的半衰期分别为86.9 h和70.9 h,在55℃下的半衰期分别为5.1 h,4.0 h。细胞经破碎以后,包埋后颗粒对底物的转化速率有所提高。海藻酸钠固定化细胞碎片中加入0.3%（v/v）底物后,在260 min后基本转化生成丙烯酸。海藻酸钠和壳聚糖两种载体包埋细胞碎片后可重复使用批次分别为8批和6批。以野生菌A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99的基因组DNA为模板,利用PCR成功调取了A.nitroguajacolicus ZJUTB06-99腈水解酶基因,并将其进行了测序,将获得的腈水解酶基因连接表达载体pTrc99a和pED20b,构建得到重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT和BL21（DE3）/pET20b-NIT,经IPTG诱导后,重组大肠杆菌JM109/pTrc99a-NIT和BL21（DE3）/pET20b-NIT中的腈水解酶活力分别为4.23,6.15 U/g DCW。